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L’enzima Gas1p, potenziale bersaglio per antifungini: espressione dei singoli domini in Pichia pastoris e loro caratterizzazione

Informazioni tesi

  Autore: Raffaella Gatta
  Tipo: Tesi di Laurea
  Anno: 2004-05
  Università: Università degli Studi di Milano
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biotecnologie per l'industria e per l'ambiente
  Relatore: Laura Popolo
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 151

Gas1p è una glicoproteina di S. cerevisiae, di 130 kDa, ancorata alla membrana plasmatica attraverso un glicosilfosfatidil inositolo (GPI). Essa presenta una struttura a domini di tipo modulare, la cui stabilità è assicurata dalla formazione di cinque ponti disolfuro intramolecolari. Si distinguono: un dominio N-terminale, sede dell’ attività (1,3)-glucanosiltransferasica richiesta per il corretto assemblaggio dei polimeri della parete cellulare; una regione linker; un dominio ricco in cisteine (Cys-box); e un dominio ricco in serine (Ser-box). Dal momento che sono stati rinvenuti diversi omologhi di Gas1p in altri lieviti e funghi patogeni per l’uomo, lo studio di questa proteina potrebbe risultare interessante da un punto di vista biotecnologico, in quanto potenziale target molecolare per nuovi farmaci antifungini diretti contro la formazione della parete cellulare.
Lo scopo del tirocinio di tesi è stato quello di proseguire la caratterizzazione dettagliata dell’enzima Gas1 di lievito tramite l’espressione eterologa di diverse forme solubili in Pichia pastoris. Forme recanti progressive riduzioni all’estremità C-terminale sono state espresse e secrete in questo microrganismo. La regione più piccola ottenuta è stata la sGas1368-H6, contenente il dominio catalitico e il linker. Sono stati determinati i livelli di espressione delle proteine, risultati pari a 50μg/ml, dopo 48 h dall’induzione. Inoltre, dai profili di glicosilazione delle proteine purificate è emerso che il contributo delle catene N-glicosidiche è concentrato soprattutto nel dominio catalitico. Un saggio enzimatico dell’attività endo-(1,3)-glucanasica ha evidenziato che sia sGas1374 che sGas1368 non possiedono attività enzimatica. E’ stato così ipotizzato che il Cys-box risulti indispensabile per lo svolgimento dell’attività catalitica di questo enzima.
Per verificare se la regione ricca in cisteine potesse rappresentare un modulo di legame di tipo non catalitico al glucano (CBM), capace di conferire alla proteina un’elevata affinità per la laminarina, è stata utilizzata la tecnica dell’elettroforesi d’affinità. Si sono analizzate in parallelo la proteina Gas1 contenente il Cys-box (sGas1482) e una priva (sGas1374): la prima non ha mostrato un’alta affinità per la laminarina (β-1,3-glucano). Questo e altri risultati, pur non escludendo la possibilità che il Cys-box influisca in qualche modo sulla capacità di legame della proteina al substrato, rendono improbabile una sua funzione di CBM come, invece, è stato riscontrato in molti enzimi idrolitici, quali cellulasi, chitinasi e anche per la β-1,3-glucanasi Ole e 9 di ulivo, il cui Cys-box presenta un’identità di sequenza del 30% con il Cys-box di Gas1p.
Successivamente, si è proseguito lo studio del dominio del Cys-box, attraverso la sua espressione in P. pastoris. Allo scopo di definire i confini di questa regione, sono stati ottenuti diversi costrutti, due dei quali sono stati oggetto di questa tesi: uno contenente il motivo completo di otto cisteine (CB –L, aa 350- 482), l’altro contenente anche il putativo linker in posizione N-terminale rispetto al Cys-box (CB +L, aa 334- 482). Si è ottenuta l’espressione e secrezione della forma CB –L, di circa 30 kDa e corrispondente al Cys-box correttamente processato ma abbondantemente modificato mediante N- e O-glicosilazione.
Infine, impiegando la tecnica del dicroismo circolare, è stata intrapresa una prima analisi strutturale delle proteine Gas1 ricombinanti. La proteina Gas1 presenta una conformazione stabile, in cui la struttura β è predominante. Dagli spettri differenziali ottenuti, il dominio Cys-box risulta costituito principalmente di α eliche e il Ser-box è prevalentemente in random-coil. Esperimenti di unfolding termico hanno fornito indicazioni sulla stabilità al calore delle forme prodotte.

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1 INTRODUZIONE La parete cellulare dei lieviti e dei funghi è diventata negli ultimi anni un promettente bersaglio per lo sviluppo di nuovi antifungini ed, in particolare, quelli destinati ad uso terapeutico nell’uomo. Questa tesi riguarda la caratterizzazione di un enzima attivo sulla parete, il quale potrebbe rappresentare un bersaglio molecolare interessante in questo ambito di studi. Prima di intraprendere un approccio di tipo biotecnologico volto ad identificare inibitori della biogenesi della parete, è importante esaminare le molecole terapeutiche attualmente in uso e le previsioni di sviluppo del mercato degli antifungini per i prossimi anni. 1. LE MICOSI E GLI AGENTI ANTIFUNGINI 1.1 TIPI DI MICOSI I miceti o funghi sono microrganismi eucariotici unicellulari non fotosintetici, capaci di crescere o in maniera isolata o aggregandosi, grazie alla formazione di un insieme di filamenti, detti “ife”, le quali, ramificandosi e intrecciandosi, costituiscono una struttura nota come micelio. Grazie alle dimensioni maggiori rispetto a quelle batteriche, i miceti sono stati scoperti quali agenti patogeni molto prima dei batteri. Oggi, circa 100 delle diverse migliaia di specie di miceti conosciute sono classificate come agenti patogeni, capaci di causare micosi.

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Parole chiave

antifungini
carbohidrate binding module
cys-box
gas1p
gpi-protein
proteina modulare

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