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Produzione di mutanti auxotrofi in Trichoderma

Gli isolati fungini appartenenti al genere Trichoderma sono eterogenei nella struttura e nel comportamento; si tratta, nella maggior parte dei casi di funghi asessuati mitosporici. Nonostante l'importanza del genere, ci sono ancora molti problemi concernenti la classificazione tassonomica delle relative specie costituenti.
Rifai adottò il concetto di “specie aggregate” e divise il genere Trichoderma in nove “specie aggregate” basandosi sulle caratteristiche morfologiche (Fenotipo) e ammettendo che alcune di loro (particolarmente Trichoderma hamatum) probabilmente contengono due o più specie morfologicamente indistinguibili. Successivamente Bissett modifico lo schema di “specie aggregate” di Rifai e stabilì una suddivisione del genere in cinque sezioni: Longibrachiatum, Pachybasium, Trichoderma, Saturnisporum e Hypocreanum. Sebbene numerosi tentativi siano effettuati mediante l’impiego di tecniche molecolari per la classificazione di Trichoderma spp., tuttavia sono necessari ulteriori studi per ottenere informazioni più precise riguardanti la tassonomia del genere.
Poche informazioni sono disponibili circa il fenomeno della compatibilità vegetativa (vc) in Trichoderma. In altri funghi questa è stata abbondantemente studiata attraverso l’impiego di mutanti auxotrofici, relativi al ciclo dello zolfo e dell'azoto, definiti mutanti “sul” e “nit”.
In questo elaborato finale sono stati impiegati isolati appartenenti a otto diverse specie del genere Trichoderma (T. asperellum, T. aureoviride, T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. saturnisporum, T. virens e T. viride); inoltre sono stati usati dieci isolati di T. virens I10 trasformati con la proteina fluorescente gfp, per un totale di ventotto isolati appartenenti al genere Trichoderma al fine di produrre mutanti “nit” e “sul”.
Per l’ottenimento dei mutanti auxotrofi sono stati allestiti due tipi di esperimenti, facendo crescere i funghi su due substrati tossici contenenti rispettivamente Clorato di Potassio (per i mutanti “nit”) e Selenato di Sodio (per i mutanti “sul”). Per ottenere i mutanti nit è stato utilizzato un Mezzo Minimo con l’aggiunta di Clorato di Potassio alle concentrazioni pari a 2,0 %, 3,8 % e 5,6 % (percentuale peso/volume). Non è stato possibile utilizzare percentuali superiori al 5,6 %, poiché il Clorato di Potassio cristallizzava. Per ottenere i mutanti sul è stato utilizzato Mezzo Minimo addizionato di Taurina (0,1 g L-1) e Selenato di Sodio a diverse concentrazioni pari a 0,025 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,15 % e 0,3 % (percentuale peso/volume). Le piastre incubate a 24°C (12 / 12 ore luce / buio) sono state osservate ogni giorno per una settimana rilevando il diametro delle colonie che si sviluppavano per ottenere grafici di accrescimento in presenza delle due sostanze tossiche, mentre per l’ottenimento di mutanti auxotrofi l’osservazione è stata protratta per un mese.
Gli isolati di Trichoderma sono risultati poco sensibili al Clorato di Potassio, avendo mostrato una lieve diminuzione della velocità di crescita; questo non ha permesso di ottenere mutanti nit-. Al contrario, gli isolati di Trichoderma sono risultati molto sensibili al Selenato di Sodio mostrando evidenti alterazioni della morfologia della colonia ed inibizione della crescita. Dall’esperimento con il Selenato di Sodio, è stato possibile ottenere mutanti “sul”. Dai 472 settori isolati 49 sono stati confermati come mutanti auxotrofi “sul” (equivalenti al 10,4 %). Tali mutanti possono essere impiegati nello studio della compatibilità vegetativa o nello studio del metabolismo dello zolfo in Trichoderma. Inoltre, i trasformati GFP di T. virens I10 hanno mostrato un comportamento identico al ceppo selvaggio nei confronti delle due sostanze tossiche impiegate.

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INTRODUZIONE – La Compatibilità Vegetativa - 2 - 1.1. La Compatibilità Vegetativa 1.1.1. Sistemi di compatibilità in natura La comparsa degli organismi multicellulari sulla scena evolutiva è stata possibile in seguito al riconoscimento cellula-cellula, dal quale sono derivati i fenomeni di adesione e di comunicazione (Galletti, 1995). Tali processi cellulari hanno assicurato l’integrità e reso possibile il funzionamento sincrono di tessuti ed organi così come la capacità dell’individuo di distinguere tra il “self” e il “non-self” (Misevic and Burger, 1988). L’interazione molecolare specifica è una caratteristica del fenomeno vita (Florin et al., 1994). Il riconoscimento “self / non-self” è un requisito comune a tutti gli organismi viventi. La maggior parte dei Taxa ha dei propri sistemi per l’identificazione del “self” e del “non-self”. Una delle finalità più importanti è quella di evitare l'accoppiamento attraverso il riconoscimento degli individui, cellule o gameti come differenti dal “self” (auto-incompatibilità o self-incompatibility). Inoltre, negli adulti, trova impiego nella cooperazione fra individui o cellule (auto-compatibilità o self-compatibility) per il riconoscimento parentale, per la formazione della colonia, nella fusione nucleare, nel doppio riconoscimento o nei trapianti. Non è raro che lo stesso sistema possa essere coinvolto in entrambi i livelli di riconoscimento all’interno della stessa specie (Dorak, 2003). Batteri, Protisti, Animali, Funghi e Piante hanno sviluppato ottimi sistemi di compatibilità noti da tempo. All’interno dei Regni, i Sistemi di Compatibilità più noti sono: il Sistema dei Ferormoni nei Protozoi (Weiss et al., 1995; Vallesi et al., 1995), i Sistemi di (In)-Compatibilità nei Funghi (Metzenberg, 1990; Bègueret et al., 1994; Hiscock et al., 1996; Wendland et al., 1995; Kothe, 1996), il Sistema di Auto-Incompatibilità nelle Angiosperme (Piante Floreali) (Hiscock et al., 1996; Haring et al., 1990; Kao and McCubbin, 1996) ed i Sistemi di Alloriconoscimento negli Invertebrati (Scofield et al., 1982; Grosberg, 1988; Weissman et al., 1990; Magor et al., 1992). Tutti questi sistemi sono coinvolti, soprattutto, nella prevenzione degli accoppiamenti fra individui geneticamente simili, per evitarne gli effetti nocivi. Come effetto del sistema di incompatibilità più polimorfico, il Fungo Schizophyllum commune ha il tasso massimo di “outbreeding” (98.8%) in natura. Anche nei Batteri, in cui la riproduzione è asessuale (attraverso scissione binaria), ci sono meccanismi che aumentano la diversità genetica attraverso il trasferimento orizzontale dei geni (coniugazione) (Dorak, 2003). 1.1.2. L'incompatibilità da eterocarion nei funghi L’incompatibilità somatica, nota negli Animali, nelle Piante, nei Funghi e nei Protisti (Buss, 1982; Grosberg, 1988; Nauta and Hoekstra, 1994), è espressa da una reazione d’incompatibilità successiva al contatto tessutale, tra conspecifici geneticamente differenti, ed è caratterizzata da un elevato livello di polimorfismo. Nei Funghi, l’Incompatibilità Somatica è molto comune ed è chiamata Incompatibilità Vegetativa, sebbene siano usati anche altri termini come Incompatibilità Protoplasmatica o da Eterocarion (Natua and Hoekstra, 1994) e Incompatibilità da fusione. I Funghi hanno contribuito allo studio dell’Incompatibilità Vegetativa anche perché i loro meccanismi potrebbero aiutare a capirne altri più complessi, come quelli relativi al Sistema Immunitario nell’Uomo (Galletti, 1995). Inoltre, la fusione cellulare nei Funghi può verificarsi in diversi momenti del ciclo vitale, cioè non è limitata soltanto alla fusione gametica, come avviene nella riproduzione sessuale degli Animali Superiori (Lane, 1981). I Funghi Filamentosi si sviluppano attraverso l’accrescimento dell’apice ifale, ramificazioni e fusioni ifali (anastomosi), formando una rete ifale tridimensionale (Buller, 1933). Durante il proprio sviluppo, un micelio può incontrare dei conspecifici vegetativamente compatibili e fondersi con essi, in un processo detto anastomosi e può formare un eterocarion (stato cenocitico dove due o più nuclei aploidi, geneticamente differenti, sono presenti nello stesso citoplasma). Le anastomosi avvengono normalmente tra apici ifali dello stesso individuo

Laurea liv.I

Facoltà: Agraria

Autore: Paris Kaisaris Contatta »

Composta da 79 pagine.

 

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