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Produzione di Proteine Eterologhe dal Lievito Kluyveromyces lactis

Informazioni tesi

  Autore: Elisabetta Corsi
  Tipo: Tesi di Laurea
  Anno: 2004-05
  Università: Università degli Studi di Roma La Sapienza
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Chimica
  Relatore: Michele Maria Bianchi
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 95

Obiettivo di questo lavoro è valutare la produzione di glucoamilasi e di laccasi in ceppi di K. lactis trasformati con dei vettori d’espressione che presentano il promotore inducibile del gene KlPDC1 a monte del gene eterologo.
I ceppi di K. lactis utilizzati permettono di provare l’effetto dei geni RAG3 e GCR1 sulla regolazione del promotore del gene KlPDC1 e quindi sull’ espressione di queste proteine.
Nel caso della glucoamilasi, per verificare la forza del promotore del gene KlPDC1, si è anche effettuato un confronto con un vettore d’espressione contenente il promotore costitutivo del gene GAPDH di S. cerevisiae; inoltre si è valutata la produzione di questo enzima in ceppi di lievito in cui è stato deleto il gene codificante la PDC (autoregolazione).
L’attività delle proteine eterologhe, che sono state ottenute secrete nel mezzo di coltura, è stata stimata qualitativamente e quantitativamente.

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Introduzione I lieviti sono importanti sia nella ricerca scientifica di base, sia nell’industria biotecnologica, principalmente farmaceutica ed alimentare. Questo grazie alla rapidità di crescita, alla relativa facilità con cui possono essere manipolati geneticamente rispetto ad organismi pluricellulari, e perché, grazie al loro status eucariotico, possono portare avanti la maggior parte delle to e di modifiche post traduzionali necessarie per produrre proteine eterologhe biologicamente attive. reazioni di ripiegamen Il lievito Saccharomyces cerevisiae, ad esempio, è universalmente riconosciuto come sistema modello per lo studio dell’espressione dei geni eucariotici. E’ un lievito fermentativo (anche in presenza di ossigeno più del 90% del glucosio metabolizzato viene incanalato nella via fermentativa) ed è utilizzato nella produzione di vino e birra, e nell’industria panaria. Viene anche impiegato per la produzione di proteine eterologhe e per applicazioni farmaceutiche essendo un organismo classificato GRAS (Generally Regarded As Safe). Nell’uso di S. cerevisiae per la produzione di proteine eterologhe si incontrano però diversi problemi, come basse rese (circa 1-5% delle proteine totali), bassa stabilità dei vettori plasmidici, apparato di secrezione inefficiente (spesso le proteine non si ritrovano nel terreno di coltura ma rimangono intrappolate nello spazio periplasmatico) e talvolta le proteine prodotte sono iperglicosilate, causando problemi di immunogenicità e attività biologica. Una soluzione a questi problemi è l’utilizzo di sistemi di lievito alternativi come Kluyveromyces lactis. 3

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