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Mutagenesi mirata del cDNA codificante per la proteina Rab7b

Informazioni tesi

  Autore: Carmine Dell'aglio
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2005-06
  Università: Università degli Studi di Lecce
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biotecnologie
  Relatore: Cecilia Bucci
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 39

In questo lavoro di tesi è stato mutagenizzato il cDNA codificante per la proteina Rab7b-wt con lo scopo di ottenere due mutanti di tale proteina, ovvero i mutanti T22N, dominate negativo (DN), e Q67L, costitutivamente attivo (CA). Questi mutanti causano cambiamenti nella struttura della proteina che non è più in grado di legare il GTP (mutante DN) o di idrolizzare il GTP (mutante CA). La mutagenesi è stata effettuata in un vettore in cui il cDNA di Rab7b è fuso insieme al cDNA codificante per il EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), una proteina che emette una fluorescenza verde in seguito all’irradiamento del campione con radiazioni di specifica lunghezza d’onda. In questo modo risulta possibile rilevare la localizzazione intracellulare della proteina senza utilizzare specifici anticorpi ed è possibile effettuare studi di videomicroscopia “in vivo”.

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Introduzione 1 1. INTRODUZIONE 1.1 Le proteine Rab regolano il traffico vescicolare Le proteine Rab costituiscono una famiglia di proteine che legano il GTP e prendono parte al controllo del traffico vescicolare nelle cellule eucariote. Queste proteine contengono circa 200 amminoacidi ed hanno una struttura completa simile alla proteina Ras. Come la proteina Ras, infatti, anche le proteine Rab si legano al GTP e lo idrolizzano: queste proteine, con attività GTPasica, sono anche considerate “switch protein” o “proteine interruttore” in quanto l’attività intrinseca di esse causa l’idrolisi del GTP a GDP e Pi e, contemporaneamente, il passaggio dalla forma attiva a quella inattiva della proteina stessa. La cinetica dell’idrolisi determina la durata dell’intervallo di tempo durante il quale “l’interruttore è acceso”. Il ciclo di legame-idrolisi del GTP nelle proteine Rab è un processo sicuramente coinvolto nelle fasi di regolazione della velocità di fusione delle vescicole. La funzione regolatoria è legata al compartimento di membrana in cui si localizzano (figura 1). Figura 1. Le vie del trasporto vescicolare intracellulare e la specifica localizzazione delle proteine Rab. (CCV, vescicole rivestite di clatrina; CCP, invaginazione rivestita di clatrina; EC, cellule epiteliali; IC, compartimento intermedio tra il reticolo endoplasmico e il Golgi; M, melanosomi; MTOC, centro di organizzazione dei microtubuli; SG, granuli secretori; SV, vescicole sinaptiche; T, granuli delle cellule-T; TGN, trans-Golgi network).

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Parole chiave

amplificazione pcr
appaiamento primer
centrifugazione
clonaggio del dna in vettori plasmidici
digestione di dna con enzimi di restrizione
elettroforesi du gel di agarosio
eluizione di dna dal gel di agarosio
ligazione
maxiprep dna plasmidico
mini-preparazione (miniprep) di dna plasmidico
mutagenesi mirata mediante amplificazione pcr
mutante q67l di rab7b
mutante t22n di rab7b
plasmidi
proteina rab7
proteina rab7b
proteine rab
quantificazione spettrofotometrica di dna
trasformazione e.coli
vettore plasmidico pegfp-c1

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