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Regolazione reciproca di fattori di trascrizione target di p63 in cheratinociti umani

Informazioni tesi

  Autore: Maurizio Callari
  Tipo: Laurea liv.II (specialistica)
  Anno: 2006-07
  Università: Università degli Studi di Milano
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biotecnologie industriali
  Relatore: Roberto Mantovani
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 76

Nel 1998 è stato scoperto un nuovo gene appartenente alla famiglia di p53 e noto con il nome di p63. Si tratta di un gene complesso, a cui fanno capo sei diverse isoforme generate grazie a fenomeni di splicing alternativo (isoforme α, β e γ) ed alla presenza di due distinti siti di inizio della trascrizione (isoforme TA e ΔN).
Mutazioni missenso in p63 sono state associate ad alcune sindromi umane (AEC, EEC, SHFM) che provocano malformazioni craniofacciali e agli arti, oltre che difetti negli epiteli stratificati come la pelle. Inoltre topi p63-/- mostrano una quasi totale assenza degli arti e degli epiteli stratificati, e muoiono poche ore dopo la nascita. Altri dati confermano che p63 è indispensabile sia nel “commitment” che nell’auto-mantenimento degli epiteli stratificati.
Per capire come p63 svolge la sua funzione, un passaggio imprescindibile è rappresentato dall’individuazione dei suoi targets genomici. A tale scopo nel nostro laboratorio è stato recentemente realizzato uno screening in cheratinociti umani (HaCaT) che ha portato all’individuazione e validazione di una serie di nuovi targets. Tra questi, alcuni sono a loro volta dei fattori di trascrizione (TF) potenzialmente importanti durante il differenziamento e auto-mantenimento della pelle.
In questo lavoro ho concentrato la mia attenzione su tre di questi TF target di p63: ZEB1, HBP1 ed in particolare C/EBPδ. Essi sono risultati interessanti poichè aumentano in seguito al silenziamento (di tutte le isoforme) di p63 e aumentano durante il differenziamento di cheratinociti umani, processo durante il quale si osserva anche una diminuzione di p63 (in particolare ΔNp63α).
Poiché uno switch di isoforme potrebbe essere importante durante il differenziamento, il primo obbiettivo è stato quello di stabilire se le varie isoforme di p63 hanno effetti diversi nella regolazione di questi targets. A questo scopo ho co-trasfettato le singole isoforme di p63 e dei costrutti reporter contenenti i promotori di HBP1 o C/EBPδ. Ho usato come sistema modello sia una linea cellulare derivata da osteosarcoma (U2OS, non esprimente p63) che colture primarie di cheratinociti umani (PHK). Solo in PHK ho ottenuto una repressione dei promotori sia di HBP1 che di C/EBPδ da parte di tutte le isoforme.
Il passo successivo è stato quello di verificare se i tre fattori in esame sono a loro volta capaci di regolare p63. A questo scopo ho realizzato delle co-trasfezioni con il promotore ΔNp63 a monte della luciferasi ed i singoli TF. Nessuno dei tre fattori si è dimostrato capace di transattivare il promotore ΔNp63 in PHK ed i dati sono stati confermati, in seguito ad overespressione degli stessi TF, tramite RT-PCR e, ove possibile, western blot. Tramite analisi bioinformatica, è stata però individuata una regione del promotore di ΔNp63 contenente dei siti di binding per C/EBPδ. Utilizzando vari frammenti del promotore di ΔNp63, ho potuto verificare che solo utilizzando il frammento più lungo, contenente tale regione, si ottiene una transattivazione ad opera di C/EBPδ in U2OS. Resta da stabilire se in alcune condizioni tale sito può diventare funzionalmente importante in PHK.
Inoltre per HBP1 e ZEB1 ho ampliato l’analisi tramite RT-PCR, valutando come tali fattori di trascrizione influenzano l’espressione di geni coinvolti nel ciclo cellulare e nel differenziamento. I risultati indicano che, benché un singolo fattore non sia ovviamente in grado di portare i cheratinociti ad un completo differenziamento, entrambi questi geni danno un contributo in questa direzione.
I dati ottenuti in questo lavoro di tesi, unitamente ad altri dati ottenuti nel laboratorio, indicano che i fattori di trascrizione attualmente sotto esame svolgono realmente un ruolo rilevante durante il differenziamento di cheratinociti umani.

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5 Sintesi Nel 1998 è stato scoperto un nuovo gene appartenente alla famiglia di p53 e noto con il nome di p63. Si tratta di un gene complesso, a cui fanno capo sei diverse isoforme generate grazie a fenomeni di splicing alternativo (isoforme α, β e γ) ed alla presenza di due distinti siti di inizio della trascrizione (isoforme TA e ∆N). Mutazioni missenso in p63 sono state associate ad alcune sindromi umane (AEC, EEC, SHFM) che provocano malformazioni craniofacciali e agli arti, oltre che difetti negli epiteli stratificati come la pelle. Inoltre, topi p63-/- mostrano una quasi totale assenza degli arti e degli epiteli stratificati, e muoiono poche ore dopo la nascita. Altri dati confermano che p63 è indispensabile sia nel “commitment” che nell’auto-mantenimento degli epiteli stratificati. Per capire come p63 svolge la sua funzione, un passaggio imprescindibile è rappresentato dall’individuazione dei suoi targets genomici. A tale scopo nel nostro laboratorio è stato recentemente realizzato uno screening in cheratinociti umani (HaCaT) che ha portato all’individuazione e validazione di una serie di nuovi targets. Tra questi, alcuni sono a loro volta dei fattori di trascrizione (TF) potenzialmente importanti durante il differenziamento e auto-mantenimento della pelle. In questo lavoro ho concentrato la mia attenzione su tre di questi TF target di p63: ZEB1, HBP1 e C/EBPδ. Essi sono risultati interessanti poichè aumentano in seguito al silenziamento (di tutte le isoforme) di p63 e aumentano durante il differenziamento di cheratinociti umani, processo durante il quale si osserva anche una diminuzione di p63 (in particolare ∆Np63α). Poiché uno switch di isoforme potrebbe essere importante durante il differenziamento, il primo obbiettivo è stato quello di stabilire se le varie isoforme di p63 hanno effetti diversi nella regolazione di questi targets. A questo scopo ho cotrasfettato le singole isoforme di p63 e dei costrutti reporter contenenti i promotori di HBP1 o C/EBPδ. Ho usato come sistema modello sia una linea cellulare derivata da osteosarcoma (U2OS, non esprimente p63) che colture primarie di cheratinociti umani (PHK). Solo in PHK ho

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Parole chiave

biotecnologie
c/ebp
cheratinociti
fattori
gene expression
gene regulation
hbp1
keratinocytes
p63
pelle
regolazione
skin
target
trascrizione
tumor suppressor
zeb1

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