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Approcci immunoenzimatico e biomolecolare allo screening e alla diagnosi della paratubercolosi negli allevamenti ovini

Informazioni tesi

  Autore: Silvia Maria Baroncelli
  Tipo: Tesi di Laurea
  Anno: 2006-07
  Università: Università degli Studi della Tuscia
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Scienze Biologiche
  Relatore: romolo fochetti
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 92

Il sempre maggiore interesse per le patologie degli animali da reddito, correlate in qualche modo all’uomo, ha dato una spinta fondamentale allo studio della paratubercolosi negli allevamenti ovini.
L’agente eziologico della Paratubercolosi, Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP), potrebbe avere, infatti, un possibile collegamento con la malattia di Crohn.
La paratubercolosi è una malattia cronica riscontrata principalmente nei ruminanti domestici e selvatici, che si è diffusa in maniera preoccupante in Italia e in Europa in questi ultimi anni.
Il sintomo dominante della patologia è rappresentato da una diarrea cronica profusa a carattere continuo o intermittente, che si accompagna ad un progressivo scadimento delle condizioni generali.
Il fenomeno può persistere per settimane o mesi ed assumere talvolta il carattere di una vera e propria dissenteria che conduce a cachessia.
Il MAP è eliminato con le feci rimanendo vitale sui pascoli per anni; per questo motivo la via orale, attraverso l’assunzione di alimenti e/o di acque contaminate, è considerata la via di infezione più frequente.
Nei giovani animali non è da sottovalutare la suzione di latte da mammelle imbrattate da feci infette o l’assunzione di latte infetto. La lenta e subdola modalità di diffusione, unitamente alle difficoltà diagnostiche esistenti, ne hanno permesso l’endemizzazione in numerosi paesi, con gravi ripercussioni economico-produttive.
Gli studi più recenti relativi all’applicazione di tecniche biomolecolari a scopo diagnostico sono molto incoraggianti, ma non hanno ancora permesso la messa a punto di un gold standard test.
Come evidenziato anche nella presente ricerca la sintomatologia osservata negli ovini è alquanto aspecifica e non sempre manifesta, nella pratica diagnostica non essendo disponibile un test sensibile e specifico al 100%, occorre quindi avvalersi di più tecniche contemporaneamente, sfruttando le migliori caratteristiche di ognuna.
L’isolamento batterico, ad oggi considerato il test più specifico, è piuttosto complesso e richiede alcune settimane di tempo per lo sviluppo delle colonie batteriche esso ha inoltre una scarsa sensibilità verso l’agente patogeno.
L’evidenziazione di lesioni macroscopiche a livello intestinale potrebbe fornire un ulteriore elemento diagnostico, ma, soprattutto negli ovini, queste non sono sempre evidenti e sufficientemente caratterizzate tanto da permettere una diagnosi certa.
La metodica più frequentemente utilizzata per l’evidenziazione di microrganismi alcool-acido resistenti, come Mycobacterium.a.paratuberculosis, è la colorazione Ziehl-Neelsen, semplice, rapida ed economica, che presenta anch’essa, tuttavia, alcuni limiti: permette, infatti, di evidenziare facilmente i micobatteri nel corso di infezioni multibacillari, ma risulta spesso incapace di rilevare le infezioni paucibacillari.
Qualora, quindi, si sospetti la presenza di animali infetti in un allevamento, l’indagine sierologica rappresenta un primo valido strumento per effettuare uno screeening di massa ed individuare gli animali portatori della patologia.
Scopo della presente ricerca è stato quindi quello di confrontare la sensibilità e la specificità del test sierologico ELISA su diverse matrici -siero e latte- e di avere ulteriore conferma del risultato tramite test biomolecolari quali la PCR.
I risultati di tale indagine potranno permettere inoltre di identificare, così come si è verificato nel caso di analisi sui bovini, il test più adatto secondo le varie necessità: attività profilattiche, piani di eradicazione, conferma di caso clinico, certificazione di strutture di allevamento compravendita o esportazione.

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4 INTRODUZIONE La paratubercolosi o malattia di Johne è una malattia cronica granulomatosa che colpisce principalmente l’apparato digestivo di ruminanti domestici, ma anche di ruminanti e animali selvatici come cervi, conigli, e volpi (Beard et al., 1999; Beard et al., 2001; Chiodini et al., 1984; Greig et al., 1999); la principale caratteristica di questa malattia è il lungo periodo di incubazione che può essere di alcuni mesi come di anni (Chiodini et al., 1984). L’agente eziologico, Mycobacterium.avium.paratuberculosis fa parte del genere dei micobatteri che qui ci apprestiamo ad elencare. §1 MYCOBACTERIUM Secondo la classificazione tassonomica, i micobatteri sono compresi nel philum Actinobacteria, classe Actinobacteria, ordine Actinomycetales, famiglia Mycobacteriaceae, genere Mycobacterium (Bacteriology Insight Orienting System, 2006). Il genere dei micobatteri (dal greco muces: fungo e bactérion: bastoncello) comprende batteri che hanno una forma bastoncellare dritta o leggermente piegata, la cui misura oscilla tra 0,2 a 0,6 µm di ampiezza e tra 1,0 e 10 µm di lunghezza; alcune volte possono apparire con forme ramificate, filamentose o simili a miceli, che possono frammentarsi in elementi bacillari o coccoidi; non formano ife aeree visibili. Sono immobili, asporigeni, aerobi e la loro temperatura di crescita ottimale è compresa tra i 30° e i 45°C. Anche se citochimicamente i micobatteri sono Gram positivi, difficilmente si colorano con la colorazione di Gram, a causa della particolare composizione della loro parete cellulare che presenta un alto contenuto in lipidi (60% del peso secco) ed in particolare in acidi micolici. Buoni risultati si ottengono invece con la colorazione di Ziehl–Neelsen, nella quale resistono alla decolorazione operata con una miscela di

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