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Studio della dinamica e della struttura dell'insulina tramite spettroscopia neutronica e dicroismo circolare

L’insulina è un ormone fondamentale per l’organismo umano in quanto consente al glucosio l’ingresso nelle cellule e il suo conseguente utilizzo come fonte energetica. In alcune condizioni, l’insulina puo' formare fibrille amiloidi e dare luogo a una patologia, l’amiloidosi iatrogena dell’insulina, che provoca complicanze nella cura del diabete. I meccanismi che portano alla
formazione di queste fibrille non sono ancora stati compresi. Data la complessita' del problema e la scarsita' di informazioni al riguardo, è` utile effettuare studi in vitro in cui le condizioni di eventuale formazione delle fibrille possano essere meglio controllate. In questo ambito, il primo passo è quello di studiare le trasformazioni strutturali, e dinamiche, della molecola di insulina al variare di parametri esterni, quali la temperatura. Il comportamento dell’insulina può essere quindi confrontato con quello di altre molecole che generano fibre amiloidi, quali la mioglobina, su cui in letteratura si possono trovare numerosi dati.
In questa tesi ho studiato i cambiamenti dinamici e strutturali dell’insulina bovina in funzione della temperatura. Per questo studio abbiamo svolto esperimenti presso l’istituto Laue-Langevin di Grenoble, utilizzando due diverse tecniche: (1) il dicroismo circolare, per determinare le variazioni
strutturali della proteina in soluzione per temperature da 20 a 95o C; (2) la spettroscopia neutronica, per comprendere le transizioni dinamiche di una polvere di insulina entro un intervallo da -253 a 27o C. In entrambi i casi, i risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli di analoghi esperimenti sulla mioglobina, in parte svolti in questa tesi e in parte rianalizzati.
Per quanto riguarda i cambiamenti strutturali, abbiamo visto che l’insulina è molto più resistente a subire variazioni indotte dalla temperatura rispetto alla mioglobina: a 95o C l’insulina subisce una transizione da uno stato monomerico ad uno intermedio reversibile mentre la mioglobina nel-
lo stesso intervallo di temperatura passa da uno stato monomerico ad uno stabile caratterizzato dalla formazione di fibre amiloidi. Un confronto con altre proteine, in grado di formare aggregati amiloidi all’aumentare della temperatura, ha confermato che l’ormone da noi studiato presenta una temperatura di transizione, grandezza che evidenzia il passaggio tra due stati stabili, notevolmente maggiore e quindi ha una notevole resistenza a modificare la propria struttura. Dagli esperimenti di spettroscopia neutronica svolti sia su insulina in polvere idratata al 15%, sia su mioglobina liofilizzata allo stesso stato di idratazione abbiamo visto che, anche dal punto di vista della dinamica, l’insulina è poco incline a subire variazioni. Inoltre abbiamo confrontato i nostri risultati con quelli ottenuti dal Professor Cupane e dal Dottor Schirò su un campione di mioglobina completamente disidratata. L’andamento dell’insulina, contrariamente a quanto ci si aspetta, si avvicina di più alla proteina di riferimento disidratata rispetto a quella allo stesso grado di idratazione.
Questi risultati sono stati confermati anche da un’analisi termodinamica tramite il modello di Doster e dal confronto delle costanti elastiche e pseudo-elastiche ottenute con il modello di Zaccai. Il nostro studio ha portato alla conclusione che l’insulina sia una molecola resistente alle variazioni termiche in quanto presenta una notevole “rigidità”, sia strutturale, che impedisce la formazione di fibre o la degradazione a temperature minore dei 95° C, sia dinamica, avvicinandosi maggiormente al comportamento di una proteina di riferimento disidratata che a quello di una proteina dello stesso grado di idratazione.

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Introduzione L’insulina e` un ormone fondamentale per l’organismo umano perche´ permette l’ingresso del glucosio nelle cellule e il suo utilizzo come fonte d’energia. Alter- azioni della funzione o della concentrazione di tale ormone possono provocare numerose malattie, delle quali il diabete e` la piu` frequente e conosciuta. Per dare un’idea dell’impatto sociale del problema, ma senza entrare nello speci- fico della patologia, e` sufficiente dire che il diabete, nella forma ′′giovanile′′ (diabete di tipo I) ha un’incidenza di circa 16 casi all’anno su 100000, mentre nella forma ′′dell’adulto′′ (diabete di tipo II) interessa circa un quarto della popolazione con eta` superiore ai 55 anni. Il trattamento piu` diffuso per questa patologia, l’unico esistente nel caso del diabete di tipo I, consiste in iniezioni sotto cutanee d’insulina d’origine bovi- na, suina o umana. Questo tipo di somministrazione puo` causare ai pazienti numerose e gravi conseguenze sia psicologiche che fisiche. Inoltre esistono dei casi, anche se poco frequenti, in cui l’insulina iniettata anziche´ diffondere in periferia e aumentare l’assorbimento del glucosio, si aggrega formando dei complessi fibrosi e diventando cos`ı insolubile quindi inefficace come terapia, [1, 2, 3]. Questo processo d’aggregazione e` proprio di tutte le specie d’insulina utilizzate in terapia (quali bovina, suina e umana). Studi istologici effettuati su pazienti affetti da questa complicanza, hanno dimostrato che i complessi formati dall’aggregazione dell’insulina sono del tutto analoghi agli aggregati amiloidi responsabili di alcune tra le patologie piu` gravi e diffuse al mon- do (quali il morbo di Alzheimer, l’Encefalopatia spongiforme bovina (BSE), il morbo di Parkinson). La capacita` dell’insulina di creare anche in vitro aggregati di tipo amiloide, condizione necessaria per studiare questo compor- tamento, e soprattutto la somiglianza tra queste fibre e quelle che provocano alcune tra le malattie piu` gravi al mondo, amplia l’interesse nello studio di questo ormone. Capire il meccanismo di formazione d’aggregati amiloidi puo` essere una strada per trovare delle cure o terapie piu` efficienti per le patologie degenerative, provocate dal graduale accumulo di questi aggregati fibrosi. E′ stato dimostrato che e` possibile riprodurre la formazione di fibre anche ar- tificialmente purche´ la proteina si trovi inizialmente in uno stato monomerico, condizione che si ottiene a pH acido e a basse concentrazioni [4, 5]; inoltre l’aggregazione avviene sempre secondo dei passaggi ben precisi [6], illustrati 7

Laurea liv.II (specialistica)

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Carlotta Marasini Contatta »

Composta da 132 pagine.

 

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Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.