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Profilo di espressione di microRNA in linee cellulari di osteosarcoma

Informazioni tesi

  Autore: Mirco Asprella
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2008-09
  Università: Università degli Studi di Bologna
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biotecnologie mediche
  Relatore: Giuliano Della Valle
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 50

I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti che partecipano alla regolazione spazio-temporale degli RNA messaggeri (mRNA) e della sintesi proteica, lunghe 21-23 nucleotidi, sono codificati da geni che sono trascritti dal DNA ma non tradotti in proteine. Sono processati da un trascritto primario il pri-miRNA in una corta struttura stem-loop chiamata pre-miRNA ed infine in un miRNA funzionale. La funzione dei miRNA sembra essere la regolazione genica, infatti sono complementari a delle sequenze dei mRNA, il 3’UTR. L’importante ruolo dei miRNA nei diversi modelli fisiologici suggerisce che l’alterazione del sistema di controllo possa portare a varie malattie e alla formazione di neoplasie. L’ipotesi che la perdita di miRNA porti a un processo di dedifferenziazione è supportata dal fatto che l’induzione di miRNA è strettamente correlata alla normale differenziazione cellulare. I miRNA possono essere studiati principalmente attraverso 4 tecniche: il clonaggio, il northern blot, i microarray e la real time PCR. La Real Time PCR (RT-PCR) permette la misurazione della fluorescenza prodotta dai campioni ad ogni ciclo e ottenendo al termine un grafico con la misura della fluorescenza rispetto al tempo. Questa PCR sfrutta l'attività della 5' nucleasi per tagliare una sonda durante la PCR, che contiene al 5' un reporter e al 3' un quencher. Durante la PCR il taglio della sonda provoca la separazione del reporter dal quencher che si traduce in un aumento di fluorescenza del reporter, visto che il quencher impedisce l'emissione di fluorescenza. L’osteosarcoma è il tumore primitivo maligno più frequente dell’osso, compare spesso in pazienti al di sotto dei 20 anni, gli uomini ne risultano più colpiti. Gli attuali trattamenti per i sarcomi muscoloscheletrici ad alto grado di malignità hanno raggiunto un livello di sopravvivenza che non può essere ulteriormente migliorato con le tecniche terapeutiche attuali. Per migliorare questi risultati clinici sono necessari regimi personalizzati basati su specifiche caratteristiche del tumore e su precise valutazioni del rischio. Dato che ad oggi, pochi dati sono presenti in letteratura sui miRNA sull’osteosarcoma, l’obiettivo di questo lavoro è stato quello di definire il profilo di espressione di miRNA in 3 differenti linee cellulari di osteosarcoma caratterizzate da una differente capacità di migrazione e da specifiche caratteristiche molecolari, al fine di identificare geni target correlati al potenziale metastatico delle cellule tumorali. L’analisi dell’espressione genica mediante Real Time PCR di 362 miRNA analizzati, ha evidenziato un’alterazione dell’espressione in circa il 80% nelle linee tumorali (MG-63, U2OS e 143B) rispetto alla linea sana di osteoblasti considerata come calibratore. Ogni miRNA è stato considerato più espresso nei casi in cui il valore di emissione luminosa calcolato con il metodo del risulta superiore al valore 1,5± SD e meno espresso in tutti quei casi in cui il valore si mostra inferiore a 0,5 ±SD. La nostra attenzione si e`focalizzata sui 4 miRNA in particolare: l’hsa-miR-9, hsa-miR-183, hsa-miR-196a ed hsa-miR-484. I possibili geni target di questi miRNA sono stati trovati confrontando i geni target di 2 database PicTar e TargetScan. L`analisi in silico effettuata con i due database selezionati, evidenzia le numerose problematiche riguardo l`individuazione di geni target. Il lavoro svolto risulta quindi essere la base per studi futuri, rivolti all’identificazione di specifici miRNA e loro geni target coinvolti nei processi di crescita e invasività cellulare.

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1 INTRODUZIONE 1.1 MIRNA L’RNA (acido ribonucleico) è un polimero organico risultante dalla polimerizzazione di ribonucleotidi, ogni nucleotide è composto da un gruppo fosfato, uno zucchero il ribosio e una base azotata (adenina, guanina, citosina e uracile). Gli RNA possono essere classificati in codificanti e non codificanti, della prima classe fanno parte gli mRNA, della seconda i tRNA e rRNA implicati nella traduzione genica e i siRNA, miRNA, tncRNA e snRNA implicati nella regolazione genica. I siRNA sono oligonucleotidi generati da RNA a doppio filamento lunghi 21-22 nt, la loro funzione è mediare il silenziamento genico attraverso la degradazione dell’RNA o silenziando la trascrizione(Lewin, 2006). I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti che partecipano alla regolazione spazio-temporale degli RNA messaggeri (mRNA) e della sintesi proteica (Davis et al., 2008). I miRNA sono molecole di RNA a singolo filamento lunghe 21-23 nucleotidi, sono codificati da geni che sono trascritti dal DNA ma non tradotti in proteine (Ruvkun, 2001; Figura 1). 1

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Parole chiave

143b
hsa-mir-9
mg-63
microrna
mirna
osteosarcoma
real time-pcr
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