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Caratterizzazione strutturale di una nuova lectina isolata da Boletus Edulis

Informazioni tesi

  Autore: Elisa Elentri
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2008-09
  Università: Università degli Studi di Pavia
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biotecnologie agrarie-vegetali
  Relatore: Monica Galliano
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 29

Boletus edulis lectin (BEL)

Le lectine sono proteine in grado di riconoscere in modo specifico mono ed oligosaccaridi con i quali formano legami reversibili. Hanno origine non immunitaria e non presentano attività enzimatica, cioè non alterano la struttura covalente dei ligandi glicosidici con cui interagiscono. Svolgono importanti funzioni in processi biologici quali l’adesione ed l’interazione cellulare, la sintesi glicoproteica e l’immunità innata. Lo studio di queste molecole è tuttora molto rilevante per la ricerca biomedica, in quanto oltre a permettere la tipizzazione dei gruppi sanguigni sono utilizzate per sviluppare nuovi farmaci per la terapia del carcinoma, per fronteggiare infezioni batteriche e microbiche e per separare le cellule staminali ematiche per il trapianto.
Per riconoscere ed aderire specificamente al loro ospite i funghi utilizzano una lectina che permette il riconoscimento di polimeri glicosidici. Dall’Agaricus bisporus è stata purificata e caratterizzata una lectina (ABL) che ha la capacità di formare un legame ad alta affinità con l'antigene Thomsen Friedenreich o antigene T. L'antigene T è un disaccaride, Gal?1,3GalNAc, legato a residui di serina o treonina di glicoproteine presenti sulla superficie cellulare e che, nelle cellule sane, risulta nascosto mentre è in alta percentuale esposto in cellule di carcinoma umano ed in tessuti neoplastici. ABL ha la proprietà di inibire reversibilmente la proliferazione di linee cellulari epiteliali maligne senza presentare citotossicità per cellule normali. Questo effetto si pensa sia una conseguenza del blocco selettivo operato da ABL su una specifica sequenza (Nuclear Localization Sequence) appartenente a proteine della superficie cellulare da cui dipende l'internalizzazione della proteina stessa e quindi il funzionamento della cellula.
ABL possiede due distinti siti di legame per N-acetylgalattosammina e N-acetylglucosammina e che inibisce in maniera selettiva la proliferazione di numerose linee di cellule tumorali umane. E’ stata quindi testata la presenza di proteine omologhe in altre specie di funghi e lo studio ha utilizzato il Boletus edulis.
Si è partiti dal presupposto che il secondo sito di legame è specifico per l’N-acetilglucosammina e ne è stato scelto come ligando il più comune polimero, la chitina, costituente della parete cellulare e presente in alte concentrazioni nelle cellule fungine. La metodologia per l’isolamento della lectina ha quindi utilizzato la cromatografia di affinità che, come principale passaggio di purificazione, si basa sul legame specifico ad una resina con chitina immobilizzata. É stata così isolata una lectina denominata Boletus edulis lectin (BEL).
Ne è stata ottenuta, tramite cristallografia a raggi X, la mappa di densità elettronica ad una risoluzione di 1,8 Å che permette di definire non solo la struttura dei legami peptidici ma di ottenere anche una buona risoluzione rispetto alle catene laterali.
La collaborazione con il laboratorio nel quale ho svolto il mio internato, prevedeva la determinazione della sequenza aminoacidica della lectina.
In questa tesi descrivo lo studio di caratterizzazione della struttura primaria che ho affrontato con l’impiego di tecniche elettroforetiche, cromatografiche e con la spettrometria di massa.

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3 INTRODUZIONE Boletus edulis lectin (BEL) Le lectine sono proteine in grado di riconoscere in modo specifico mono ed oligosaccaridi con i quali formano legami reversibili. Hanno origine non immunitaria e non presentano attività enzimatica, cioè non alterano la struttura covalente dei ligandi glicosidici con cui interagiscono. Furono scoperte all'interno del regno vegetale nel 1888 da Peter Hermann Stillmark, grazie all'intrinseca attività agglutinasica della prima lectina purificata, la ricina, presente nei semi di Ricinus comunis (1). Sono poi state individuate in tutti gli organismi viventi compresi animali, piante, funghi e batteri e svolgono importanti funzioni in processi biologici quali l’adesione ed l’interazione cellulare, la sintesi glicoproteica e l’immunità innata. Lo studio di queste molecole è tuttora molto rilevante per la ricerca biomedica, in quanto oltre a permettere la tipizzazione dei gruppi sanguigni sono utilizzate per sviluppare nuovi farmaci per la terapia del carcinoma, per fronteggiare infezioni batteriche e microbiche e per separare le cellule staminali ematiche per il trapianto. I funghi sono organismi eterotrofi, hanno una parete cellulare formata da chitina e dipendono dal processo di simbiosi per ottenere fonti di energia. Le ife fungine formano uno spesso strato attorno alle radichette terminali di alberi superiori, arbusti o erbe, stabilendo con esse uno scambio continuo di sostanze nutritive: il fungo ottiene mono ed oligosaccaridi permettendo in cambio alla radice di utilizzare la vasta superficie del micelio per assorbire dal terreno acqua e sali minerali. Il fenomeno, detto micorriza, si realizza per semplice contatto. Per riconoscere ed aderire specificamente al loro ospite i funghi utilizzano una lectina che permette il riconoscimento di polimeri glicosidici. Ci sono più di 140 funghi simbionti con corpi fruttiferi commestibili, un gruppo che include alcuni tra gli alimenti più costosi e diffusi al mondo. All'interno di questo gruppo il genere Boletus ospita molte tipologie di fungo, altamente apprezzati per il gusto, e numerose specie, strettamente correlate per morfologia, sono generalmente definite Boletus edulis. Il genere Boletus non è ancora coltivato mentre lo è un'altra specie molto comune e diffusa, l’Agaricus bisporus, e ciò spiega il fatto che il suo consumo sia significativamente maggiore. Dall’Agaricus bisporus è stata purificata e caratterizzata una lectina (ABL) che ha la capacità di formare un legame ad alta affinità con l'antigene Thomsen Friedenreich o antigene T. L'antigene T è un disaccaride, Galβ1,3GalNAc, legato a residui di serina o treonina di glicoproteine presenti sulla superficie cellulare e che, nelle

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Parole chiave

analisi esi/lc/ms/ms dei peptidi ottenuti da diges
boletus edulis lectin
caratterizzazione strutturale
cromatografia a scambio ionico
digestione enzimatica “in gel”
dosaggio proteico
elettroforesi bidimensionale
elettroforesi con sodio dodecil solfato
sequenziamento proteico
spettrometria di massa esi

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