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Screening biochimico e molecolare del gene HBB: confronto tra differenti metodologie di analisi

Introduzione
Le emoglobinopatie comprendono un vasto gruppo di disordini genetici causati da alterazioni a livello dell'emoglobina; con una frequenza del 7% nella popolazione mondiale sono considerate le malattie monofattoriali più diffuse.
Le alterazioni a carico della molecola emoglobinica possono essere di tipo quantitativo o qualitativo: del primo gruppo fanno parte le sindromi talassemiche, del secondo le varianti strutturali, o emoglobine anormali. Le sindromi talassemiche che hanno maggiore rilevanza clinica sono le α- e β-talassemie, causate rispettivamente da mutazioni a carico dei geni per l'α- e la β-globina. Le varianti strutturali più frequenti sono rappresentate dalle emoglobine S, C ed E.

Scopo della tesi
Il confronto tra i risultati ottenuti con metodiche di biochimica clinica e quelli ottenuti con indagini genetiche in soggetti con sospetta emoglobinopatie/talassemia ha permesso di sottolineare come la qualità analitica possa essere validata dalla corretta interazione di metodologie di indagine diverse e di valutare, quindi, la loro utilità e le possibili implicazioni e applicazioni nella presa in carico del paziente.

Materiali e metodi
Su 31 campioni di sangue periferico si è condotto un primo screening in HPLC che ha permesso di determinare le frazioni emoglobiniche (fetale, glicata e A2) e di discriminare i campioni sani da quelli con emoglobine patologiche. Nei casi in cui non si sia ottenuto una corretta separazione ed identificazione delle varianti strutturali, è stata eseguita l'analisi in Elettroforesi Capillare. L' analisi molecolare del gene HBB è stata eseguita mediante sequenziamento diretto secondo il metodo Sanger.

Risultati
I risultati ottenuti con HPLC ed Elettroforesi Capillare sono stati confermati o chiariti dall'analisi delle sequenze. L'emoglobina variante S è stata riscontrata in 11 pazienti (6 allo stato eterozigote, 5 in omozigosi); la variante C in 2 pazienti, in entrambi allo stato eterozigote; la variante E in 2 pazienti, in uno in omozigosi, nell'altro in eterozigosi. In 2 pazienti è stata confermata la presenza di variante S ma esclusa la presenza di mutazioni riconducibili a β-talassemia; in 10 casi è stata confermata la presenza di mutazioni patogenetiche per β-talassemia; 2 campioni presentano eterozigosi composte ed infine in un paziente si è esclusa la presenza di mutazioni riconducibili a β-talassemia.

Discussione/Conclusioni
In questo lavoro abbiamo voluto presentare il confronto tra metodologie differenti in quanto l'obiettivo finale del laboratorio deve essere quello di fornire informazioni clinicamente utili riducendo al minimo i motivi di incertezza nella conclusione diagnostica e si è voluto sottolineare come la qualità analitica dipenda dalla corretta interazione di metodologie di indagine, compresa la valutazione genetica.

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1 1- Introduzione Le emoglobinopatie sono un gruppo eterogeneo di difetti congeniti dell'emoglobina e sono considerate le malattie genetiche monofattoriali più diffuse a livello mondiale; è stato infatti stimato che circa il 7% della popolazione è portatore di mutazioni nel gene per la beta- globina (1). Originariamente tali patologie erano diffuse esclusivamente nelle popolazioni di origine Africana, Asiatica e Mediterranea; il fenomeno della migrazione delle popolazioni e i matrimoni tra diversi gruppi etnici hanno contribuito a far diffondere la talassemia in quasi tutti i paesi del mondo, incluso il Nord-Europa e tutto il continente americano, paese in cui la talassemia era precedentemente assente. E' stato stimato che circa l'1,5% della popolazione mondiale (80-90 milioni di persone) sono portatori di β-talassemia, con circa 60.000 nuovi nati sintomatici all'anno, per la maggior parte nei paesi in via di sviluppo. L'incidenza totale annuale di individui sintomatici è stata stimata in 1 caso su 100.000 nella popolazione mondiale e di 1 su 10.000 persone nei paesi dell'Unione Europea. In ogni caso, dati accurati sul tasso dei portatori in molte popolazioni sono mancanti, soprattutto in quelle aree del mondo che sono note per essere gravemente affette (2). Data l'elevata diffusione, queste malattie sono state intensamente studiate sia dal punto di vista clinico che dal punto di vista genetico e molecolare; gli studi che furono condotti agli inizi del Novecento chiarirono le proprietà della molecola e i meccanismi di sintesi; nel 1959 Max Perutz definì, mediante cristallografia a raggi X, la struttura chimica dell'emoglobina. Negli anni Settanta iniziarono ad essere sviluppate le tecniche di indagine di genetica molecolare che hanno permesso poi di individuare i meccanismi patogenetici alla base delle emoglobinopatie mediante lo studio diretto dei geni globinici. 1.1 Struttura e Funzione dell'emoglobina L'emoglobina (Hb) è una proteina globulare complessa costituita da un tetramero di catene globiniche, contenuta nei globuli rossi. Le catene del tetramero sono uguali a due a due e ognuna è legata ad un gruppo prostetico, il gruppo eme, contenente un atomo di ferro che, allo stato ferroso ( Fe2+), è capace di legare reversibilmente l'ossigeno molecolare, di trasportarlo e di cederlo ai tessuti che ne sono poveri. Esistono sei catene che combinandosi tra loro, a due a due, danno origine ad emoglobine diverse (Fig. 1), le quali differiscono tra loro per alcune caratteristiche chimico-fisiche, fra

Laurea liv.I

Facoltà: Medicina e Chirurgia

Autore: Benedetta Piombanti Contatta »

Composta da 54 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 780 click dal 14/12/2012.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.