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Subproteomi delle membrane mitocondriali di muscolo cardiaco bovino: nuove metodologie di isolamento

Scopo di questo lavoro è stato quello di testare differenti strategie di frazionamento subcellulare, d’estrazione, di solubilizzazione e di purificazione di proteine integrali di membrana, da mitocondri di muscolo cardiaco bovino, utili alla completa caratterizzazione strutturale delle proteine d’interesse mediante metodologie proteomiche. Il subproteoma delle membrane mitocondriali di muscolo cardiaco bovino è stato quindi sottoposto a frazionamento chimico, allo scopo di ottenere frazioni semplificate di proteine e spots elettroforetici definiti, impiegati per l’identificazione e la caratterizzazione delle proteine d’interesse mediante spettrometria di massa MALDI MS e MS/MS. Tale approccio ha permesso l’identificazione di due trasportatori della membrana mitocondriale interna: il carrier del 2-chetoglutarato e l’ isoforma del carrier dei nucleotidi adeninici: AAC1, inoltre, sono state identificate due isoforme della proteina di membrana mitocondriale esterna denominata porina o Voltage-Dependent Anion Channel (VDAC1 e VDAC2).

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Introduzione 1 INTRODUZIONE Le proteine integrali di membrana presiedono a gran parte dei processi biologici e costituiscono il bersaglio di una notevole quantità di farmaci. L’impiego di diverse strategie biochimiche, biofisiche e di biologia molecolare hanno fornito informazioni complementari, preziose per identificare e caratterizzare un numero elevato di proteine di membrana, limitando però le conoscenze strutturali. Ad oggi, la cristallizzazione di proteine integrali di membrana risulta essere estremamente difficoltosa, a causa della disponibilità, generalmente limitata, di materiale proteico di partenza, che rende impraticabile una purificazione diretta dai tessuti. Ulteriori limiti sono rappresentati dall’elevata tendenza all’aggregazione e dalla natura idrofobica di queste proteine, fattori che influenzano fortemente la solubilità e quindi condizionano la scelta di adeguati detergenti. Questi ultimi rivestono un ruolo fondamentale nell’isolamento e nella purificazione delle proteine dai tessuti, poichè ne permettono la solubilizzazione. Lo step di solubilizzazione di questo tipo di proteine porta alla destabilizzazione della componente lipidica di membrana, con formazione di frammenti lipidici, frammenti di membrana e di proteina. La solubilizzazione e la successiva incorporazione di proteine di membrana aventi funzione di trasporto (carriers) all’interno di vescicole fosfolipidiche (dette liposomi) permette di purificare e caratterizzare funzionalmente questo tipo di proteine seguendone l’attività di trasporto. A tale scopo, dopo ogni step di purificazione, viene misurata la concentrazione proteica totale e l’attività di trasporto del carrier d’interesse, per valutare il grado di arricchimento proteico delle varie frazioni purificate. Tali metodi seppur sensibili, non permettono nè di effettuare un’identificazione non ambigua ed univoca della proteina d’interesse, né di caratterizzarla strutturalmente. L’analisi e caratterizzazione di proteine di membrana mediante approccio proteomico rappresenta oggi un importante obiettivo della proteomica, poiché esse costituiscono il

Laurea liv.II (specialistica)

Facoltà: Farmacia

Autore: Simona Parrotta Contatta »

Composta da 83 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 361 click dal 26/03/2013.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.