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Discriminazione chimica e molecolare di due specie endemiche della Sardegna: Salvia desoleana Atzei et Picci e Salvia sclarea L.

Informazioni tesi

  Autore: Francesca Sanna
  Tipo: Tesi di Laurea Magistrale
  Anno: 2010-11
  Università: Università degli Studi di Torino
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biotecnologie agrarie-vegetali
  Relatore: Massimo Maffei
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 66

Le piante forniscono all’uomo prodotti naturali di grande utilità che trovano impiego come coloranti, fibre, cere, oli, aromi, droghe, ecc. Considerato il vasto utilizzo dei prodotti di origine vegetale, è importante mettere a punto metodiche di selezione e caratterizzazione del materiale vegetale che tengano conto del profilo fitochimico, metabolico e produttivo che ne facilitino l’individuazione tra i prodotti sotto l’aspetto qualitativo.
Scopo di questa tesi è la caratterizzazione chimica e l’applicazione di tecniche biomolecolari per la distinzione di due specie endemiche della Sardegna appartenenti al genere Salvia, in particolare S. desoleana (SD) e S. sclarea (SS). Le indagini sono state effettuate attraverso l’analisi gas cromatografica abbinata a spettrometria di massa dell’olio essenziale e l’indagine biomolecolare-genomica di sequenze NTS del gene 5S-rRNA con tecniche di DNA barcoding, integrate da analisi statistiche. I risultati ottenuti hanno permesso di caratterizzare e discriminare le due specie oggetto della tesi.
Aa seguito di un’analisi comparativa della composizione degli oli di SD e SS, sono state osservate similarità nel tipo e nella percentuale dei monoterpeni idrocarburici presenti, mentre riguardo ai monoterpeni ossigenati vi sono differenze sia nel tipo sia nella percentuale (1,8-cineolo e terpinil acetato nella SD, acetato di linalile e linalolo per la SS). I sesquiterpeni idrocarburici sono presenti in entrambe le specie, ma in percentuale maggiore nella SD (germacrene D; β-cariofillene; γ-muurolene). I sesquiterpeni ossigenati sono presenti lo spatulenolo e il cariofillene ossido in entrambe le specie, ma in misura di quasi cinque volte maggiore nella SD. Infine l’elemento che discrimina notevolmente le due specie è la presenza del diterpene sclareolo nella SS, assente nella SD, quest’ultima presenta però un diterpene ossigenato (sclareoloside).
L’analisi statistica è stata eseguita attraverso PCA (analisi dei componenti principali) e la CA (cluster analysis) calcolate sui principali composti presenti negli oli essenziali delle specie in esame.
Questa diversità di composizione degli oli è correlata a quanto osservato nelle analisi biomolecolari anche se non bisogna dimenticare che i luoghi di raccolta differenti, soggetti a diverse condizioni pedoclimatiche, possono essere responsabili di diverse espressioni fenotipiche dovute a plasticità.
L’allineamento delle sequenze, relative alla regione NTS fiancheggiante al 3’- e al 5’- terminale il gene 5S-rRNA, ha evidenziato sostanziali differenze tra i diversi campioni. È presente una regione altamente conservata tra i campioni nelle zone fiancheggianti i primers forward e reverse, una regione mediamente conservata per circa 50 bp, con un grado di similarità del 50% circa. Seguono zone di notevoli gap separate da allineamenti senza appaiamento. Una situazione d’omologia si verifica nella regione a monte di circa 80 nucleotidi del primer 5S-P2: i campioni presentano sequenze con un medio grado di similitudine e la presenza di un solo gap di 9 bp.
Sono stati costruiti gli alberi filogenetici (filogrammi) che mettono in evidenza le relazioni tra i vari campioni sulla base della sequenza nucleotidica, includendo sia sequenze di altre salvie relative al gene 5S ribosomale sia sequenze di altre specie vegetali utilizzate come outgroup in modo da confermare l’appartenenza delle salvie allo stesso gruppo. L’analisi delle distanze attraverso il metodo NJ (Neighbor Joining) ha portato in evidenza di tre cladi principali.
Sulla base delle sequenze nucleotidiche ottenute dal sequenziamento è stato possibile selezionare con analisi in silico gli enzimi di restrizione necessari per ottenere un profilo di restrizione. L’enzima più appropriato è risultato essere ApaI e dalla ricostruzione in elettroforesi capillare, il campione SD ha generato due frammenti differenti per lunghezza dal campione SS. Un’ulteriore restrizione enzimatica è stata effettuata con l’enzima BamHI, in grado di generare frammenti dal profilo più discriminante.
L’applicazione della tecnica PCR e PCR-RFLP allo studio piante essenziere come quelle appartenenti al genere Salvia potrebbe avere risvolti applicativi in quanto risultano un valido strumento per il controllo di qualità e l’individuazione di frodi relative al materiale vegetale impiegato per la produzione di prodotti a base di salvia e suoi composti.

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5 1. INTRODUZIONE Durante il corso degli ultimi secoli si è assistito ad una svolta radicale della botanica, in particolare al modo di determinare e caratterizzare le specie del regno vegetale. Nel XVIII secolo lo svedese Carl von LinnØ (Linneo, 1707-1778), tenendo conto del numero degli stami, dei pistilli e della loro organizzazione, sviluppa una suddivisione in classi, ordini, generi e specie che, adottando la nomenclatura binomiale, permette di identificare ogni organismo vivente. Nel corso del XIX secolo, con lo sviluppo della chimica organica, vengono determinate le strutture chimiche di molti dei composti isolati. Questo sviluppo è proseguito con una velocità sempre crescente nei decenni seguenti. Dal 1950 l’interesse si è focalizzato sulle reazioni mediante le quali le piante producono queste molecole biologicamente attive. Gli organismi viventi producono molti tipi di prodotti naturali in quantità variabili e spesso la via biosintetica responsabile della produzione di questi composti è differente tra i gruppi tassonomici. La distribuzione di questi composti e le loro vie biosintetiche corrispondono meglio delle classificazioni tassonomiche esistenti, basate sul criterio morfologico. I dati chimici sono stati piø volte utilizzati per sopperire alla difficoltà che talvolta si incontrano nella classificazione tradizionale delle specie, in alcuni casi questi hanno contraddetto le ipotesi esistenti o, piø positivamente, hanno fornito informazioni decisive in situazioni in cui i dati morfologici non erano sufficientemente discriminatori (Maffei, 1999). Con l’ausilio delle nuove tecniche di biologia molecolare si è in grado di evidenziare la variabilità a livello di sequenze del DNA, ovvero il polimorfismo genetico. PoichØ il materiale genetico di un organismo è identico in tutte le cellule dei suoi tessuti e in ogni momento della sua vita, il DNA può essere ottenuto da qualsiasi parte della pianta (es. radici, legno, foglie o semi) e l’analisi può essere effettuata in qualsiasi periodo. Le caratteristiche del DNA non sono influenzate dallo stato della pianta e quindi le analisi basate sulle tecniche di barcoding generano un sistema robusto di riconoscimento tra le specie. Lo sviluppo della Polymerase Chain Reaction (PCR), nella metà degli anni ‘80, ha rappresentato una vera rivoluzione per tutta la biologia. La PCR è una tecnica notevole che implica la sintesi enzimatica in vitro di milioni di copie (amplificazione) di un segmento specifico di DNA in presenza dell’enzima DNA polimerasi. I prodotti di amplificazione permettono di ottenere “fingerprinting” genomici di individui, varietà e popolazioni di specie anche poco studiate e per le quali non sono ancora disponibili molte informazioni di sequenza. ¨ soprattutto l’analisi biosistematica che sta modificando le interpretazioni filogenetiche ottenute da dati morfologici. Numerosi sono i casi in cui le sequenze di DNA ribosomiale o

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