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Sviluppo e caratterizzazione di un Adenovirus oncolitico replicativo dipendente dal micro-RNA-199 per la Terapia dell'epatocarcinoma

L’epatocarcinoma (HCC) è la terza maggiore causa di morte dovuta a tumore nel mondo. Ad oggi le terapie tradizionali sono perlopiù inefficaci e risulta perciò necessario sviluppare nuovi approcci terapeutici. Alla base del nostro studio è l’evidenza che i microRNA, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica e sono deregolati nei tumori umani. In particolare, il microRNA-199 (miR-199), viene espresso ad alti livelli nel fegato sano mentre è silente in HCC.

In base a questi presupposti, il lavoro di tesi si è proposto lo sviluppo di un vettore adenovirale replicativo condizionale microRNA-dipendente, in grado di provocare danni alle cellule tumorali del fegato sia per lisi diretta dovuta alla sua replicazione, sia per effetto del gene suicida timidina chinasi (TK) dell’herpes simplex virus.

Il virus è stato ottenuto utilizzando un vettore adenovirale di prima generazione non replicativo, in cui è stata ripristinata la capacità di replicazione reintroducendo i geni virali E1A/E1B. Nel vettore virale è stato anche introdotto il gene TK, che è in grado di attivare il pro-farmaco ganciclovir in un metabolita citotossico. Per limitare la replicazione del virus e l’espressione del gene terapeutico unicamente alle cellule tumorali, è stata sfruttata l’espressione differenziale del miR-199. A questo scopo, copie multiple della sequenza bersaglio del miR-199 sono state clonate a valle del gene E1A e del gene TK. In tal modo, la replicazione virale e l’espressione del gene suicida saranno bloccate in cellule normali esprimenti il miR-199, mentre saranno attive in cellule tumorali, dove l’espressione del miR-199 è bassa o assente. Per verificare questa ipotesi, sono stati prima effettuati esperimenti in vitro che hanno permesso di dimostrare che l’espressione del gene TK è miRNA-dipendente. Successivamente abbiamo dimostrato che anche la replicazione del virus Ad199T/TK199T è dipendente dal miR-199 sia in vitro che in vivo, utilizzando come controllo un adenovirus ricombinante la cui replicazione è indipendente dal microRNA.

Pertanto, i risultati di questa tesi indicano che il virus Ad199T/TK199T è in grado di bersagliare selettivamente le cellule di epatocarcinoma, limitando gli effetti tossici a carico del tessuto epatico sano.

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________________________________________________________________________________ 5 INTRODUZIONE IL CARCINOMA EPATOCELLULARE Il tumore è il risultato di una crescita cellulare incontrollata. Nel cancro, una cellula dell’organismo non risponde più ai segnali che indicano alle cellule normali di crescere, smettere di crescere o addirittura di morire. Questi cambiamenti sono spesso il risultato di modifiche al DNA (mutazioni). Poiché ci sono molte e diverse alterazioni, che sono in grado di mutare il DNA, ci sono un numero altrettanto grande di cause di cancro (http://www.cancerquest.org.). Il carcinoma epatocellulare (HCC, hepatocellular carcinoma) è un tumore primario del fegato. È il quinto tipo di cancro più comune nell’uomo e la terza maggiore causa di morte dovuta a tumore nel mondo. Ogni anno nel mondo ci sono più di 600.000 nuovi casi di HCC, che arrivano a rappresentare il 4% di tutti i nuovi tumori diagnosticati [1]. Anche se la maggior parte dei casi si registrano in Asia e in Africa, l’incidenza sta aumentando stabilmente nell’Occidente negli ultimi 20 anni [2]. Il fattore di rischio maggiore per lo sviluppo dell’HCC è l’infezione cronica con HBV, che avviene per il 52% di tutti i casi di HCC, seguita dall’infezione cronica da HCV e dall’assunzione di alcool [3]. HBV infetta approssimativamente 350 milioni di persone nel mondo, con un riscontro maggiore in Asia e Africa. In Europa, l’HCC dovuta all’epatite B, si verifica principalmente in pazienti con una cirrosi conclamata, mentre in Asia i portatori di Epatite B senza cirrosi sono a rischio di sviluppare HCC, indipendentemente dalla stato replicativo[4]. Il processo di sviluppo dell’epatocarcinoma è caratterizzato da diversi step e circa l’80% degli HCC si sviluppa in fegati cirrotici [5]. Lo stesso rischio di sviluppare l’HCC dopo infezioni virali, è maggiore nei pazienti con cirrosi [6, 7], mentre l’incidenza cumulativa di 5 anni, in pazienti non cirrotici è inferiore la 5% [8]. L’abuso di alcol è una delle maggiori cause di cirrosi al fegato e di HCC nella maggior parte dei paesi occidentali [9]. Inoltre, l’associazione di alcol, infezioni virali di epatiti croniche, e altri fattori di rischio metabolico ha un effetto cancerogeno sinergico [10, 11]. In tutte le eziologie c’è la predominanza del genere maschile ad essere colpito [1]. Questo probabilmente è dovuto all’alto tasso di esposizione a cancerogeni del fegato e all’infezione dei virus dell’epatite nell’uomo o all’inibizione mediata dall’estrogeno della

Laurea liv.II (specialistica)

Facoltà: Farmacia

Autore: Gaia Nellini Contatta »

Composta da 98 pagine.

 

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Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.