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Ruolo di REST nella rigenerazione muscolare

Informazioni tesi

  Autore: Antonio Scopelliti
  Tipo: Tesi di Laurea Magistrale
  Anno: 2015-16
  Università: Università degli Studi di Milano
  Facoltà: Scienze e Tecnologie
  Corso: Biologia molecolare e cellulare
  Relatore: Graziella Messina
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 61

REST (Repressor Element 1 Silencing Transcription factor, anche conosciuto come Neuron-Restrictive Silencing Factor, NRSF) è un repressore della trascrizione genica ubiquitario ed è considerato un regolatore primario della neurogenesi, processo legato alla formazione di nuove cellule nervose a partire da cellule staminali neurali o da cellule progenitrici. REST è in grado di legare una sequenza conservata, denominata elemento repressivo 1 o RE1, inibendo la trascrizione di geni neuronali in cellule staminali neurali (NSCs) e in cellule non neuronali. La sequenza RE1, infatti, è localizzata nei promotori di molti geni neuronali; REST è in grado di formare un complesso di repressione trascrizionale con due cofattori, CoREST e mSin3. È, inoltre, associato a diversi enzimi responsabili di modificazioni istoniche, tra i quali le istone-deacetilasi (HDACs). Molti lavori hanno dimostrato che le HDACs interagiscono con il complesso di REST per esplicare una funzione repressiva, non solo a livello del sistema nervoso centrale, ma anche nel tessuto muscolare cardiaco, dove REST regola negativamente la trascrizione di molti geni cardiaci espressi durante il differenziamento, garantendo una normale funzionalità cardiaca. Gli enzimi istone-deacetilasi sono, inoltre, coinvolti nella repressione dei geni implicati nel differenziamento/rigenerazione del muscolo scheletrico attraverso l'interazione con i fattori regolatori della miogenesi MyoD e MEF2. In accordo con queste evidenze, abbiamo deciso di indagare il ruolo di REST come repressore trascrizionale nel tessuto muscolare scheletrico e il suo presunto coinvolgimento nel processo differenziativo. Abbiamo generato un modello murino knockout condizionale REST-Flox/MyoD-Cre al fine di indurre l'inibizione dell'espressione di REST specificamente a livello muscolare. Abbiamo eseguito delle analisi di western blotting su quadricipiti (QA) e tibiali anteriori (TA) di topi Cre+ REST Flox/Flox per confermare l'assenza di espressione di REST. Abbiamo, quindi, eseguito le analisi morfologiche del tessuto muscolare del topo Cre+ REST Flox/Flox paragonato al topo normale. I risultati di queste analisi hanno mostrato una riduzione del diametro delle fibre muscolari di tipo I nei topi Cre+ REST Flox/Flox, implicando la presenza di un processo di rigenerazione a livello muscolare. Successivamente, per valutare la presenza e il numero di cellule satelliti, abbiamo effettuato delle analisi di immunofluorescenza nei topi Cre+ REST Flox/Flox e abbiamo isolato ed espanso in vitro le cellule satelliti dai muscoli dei topi Cre+ REST Flox/Flox. Dai risultati si evince che il numero di cellule satelliti nel modello Cre+ REST Flox/Flox è simile a quello del topo wild-type e che quindi, in condizioni normali, l’assenza di REST non abbia alcuna influenza sul numero di cellule satelliti all’interno del muscolo. Infine, per meglio caratterizzare il processo di rigenerazione indotto dal knockout condizionale di REST, abbiamo condotto degli esperimenti di induzione di danno muscolare mediante iniezione intramuscolare di cardiotossina (CTX) in TA di topi Cre+ REST Flox/Flox e Cre- REST Flox/Flox. I topi sono stati sacrificati a 2, 5, 7 e 10 giorni dopo il trattamento. A 10 giorni dall’'iniezione di CTX, i muscoli Cre+ REST Flox/Flox iniettati hanno mostrato un ritardo del differenziamento delle fibre rispetto ai muscoli di topi Cre- REST Flox/Flox. Ulteriori esperimenti di immunofluorescenza sono stati condotti su sezioni di TA di topi Cre+ REST Flox/Flox in seguito a danno da CTX, per valutare il numero di cellule satelliti a 2, 5, 7 e 10 giorni dall’iniezione. Dai risultati si evince che nei topi Cre- REST Flox/Flox il pool delle cellule satelliti ha un picco massimo a due giorni dall’iniezione di CTX mentre, nei topi Cre+ REST Flox/Flox, il pool ha un picco massimo a sette giorni. Questi dati dimostrano come l’assenza di REST, in seguito a danno muscolare, porti a un ritardo nell’attivazione delle cellule satelliti rispetto ai topi controllo e quindi a uno spostamento del picco di rigenerazione nel tempo. Inoltre, la presenza di fibre immature di piccolo calibro dopo il danno muscolare che non tendono ad aumentare di diametro e ad esprimere correttamente la proteina di membrana laminina, dimostra che il repressore trascrizionale REST potrebbe essere coinvolto nel processo di differenziamento muscolare. La nostra ipotesi è che REST sia in grado di formare un complesso trascrizionale che regola il differenziamento muscolare. L'identificazione del pathway molecolare di REST potrebbe portare alla scoperta di target molecolari e quindi alla possibilità di studiare nuove e innovative terapie farmacologiche finalizzate al miglioramento dei processi di rigenerazione del muscolo scheletrico. Queste evidenze potrebbero aprire scenari futuri per il trattamento delle malattie neuromuscolari degenerative come le distrofie muscolari.

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6 INTRODUZIONE 1. REST: regolatore primario della neurogenesi. REST (Repressor Element 1 Silencing Transcription factor, anche conosciuto come Neuron-Restrictive Silencing Factor, NRSF) è un fattore di trascrizione ubiquitario che agisce inibendo la trascrizione genica ed è in grado di legare una sequenza genica di 21- 23 paia di basi (bp) altamente conservata (denominata elemento repressivo 1 o RE1), presente nei geni Scn2a2 e Stmn2 1 . La proteina REST è costituita da 1097 amminoacidi, ha un peso molecolare di 121 KDa e appartiene alla famiglia dei fattori di trascrizione zinc finger di tipo Krüppel. Questa famiglia di proteine è generalmente coinvolta nella crescita e nel differenziamento cellulare e mutazioni nei geni che codificano per queste proteine sono frequentemente correlate allo sviluppo di neoplasie 2 . REST agisce da repressore della trascrizione di geni neuronali in cellule non neuronali (cellule epiteliali, endoteliali, fibre muscolari, ecc.) e in cellule staminali neurali (NSCs). REST viene definito come un regolatore primario della neurogenesi, processo attraverso il quale si ha la formazione di nuove cellule nervose a partire da cellule staminali neurali o da cellule progenitrici 4 . La sequenza RE1 è costituita da due metà conservate, formate da 10bp ciascuna e separate da un singolo nucleotide non conservato (sequenza canonica), oppure separate da una sequenza di geni con lunghezza variabile (non canonica). La scoperta delle RE1 non canoniche è avvenuta grazie a metodi bioinformatici e di whole-genome sequencing ed ha permesso di ampliare lo spettro dei possibili target di REST, attribuendogli un ruolo non più limitato alla neurogenesi, bensì molto più complesso 5,6 . I processi in cui REST svolge un ruolo determinante comprendono la neurogenesi 7 , lo sviluppo e la funzionalità della glia 8 , lo sviluppo embrionale 9 , la modulazione della plasticità sinaptica 7 , della composizione della matrice extracellulare e dei meccanismi neuro-secretori 10 e la soppressione tumorale 11 (Figura 1).

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Parole chiave

satelliti
muscolo
cuore
differenziamento
rigenerazione
distrofia
hdac
rest
nrsf
cardiotossina

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