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Caratterizzazione strutturale e funzionale di un enzima fibrinogenolitico dal veleno del serpente Trimeresurus elegans

I veleni dei serpenti contengono varie proteine ed enzimi che esercitano differenti attività nei processi coinvolti nell’emostasi dei mammiferi. In particolare, nei veleni di vipere, sono presenti tre principali e differenti attività che interessano il sistema emostatico: l’attività fibrinogenolitica, l’attività aggregante piastrinica e quella fibrinolitica. Il fibrinogeno umano è considerato un importante fattore di rischio, quando supera certe concentrazioni, per patologie quali l'infarto al miocardio e le trombosi ischemiche. E' stato osservato che, in soggetti a rischio quali i fumatori, i diabetici, gli obesi, la concentrazione plasmatica di fibrinogeno è insolitamente elevata e che alla riduzione della stessa si accompagnerebbe una notevole diminuzione del rischio connesso alle patologie cardiovascolari. L'interesse quindi per quegli enzimi in grado di far diminuire i livelli di fibrinogeno, in quelle particolari situazione di iperfibrinogenazione, è notevolmente cresciuto negli ultimi anni.
Scopo del presente lavoro di tesi è la purificazione e la caratterizzazione funzionale e strutturale di un enzima ad azione fibrinogenolitica dal veleno della vipera Trimeresurus elegans.
La purificazione è stata effettuata sciogliendo il liofilizzato di veleno in una soluzione acquosa che è stata sottoposta ad ultrafiltrazioni sequenziali su membrane a diverso cutoff molecolare. Le frazioni ottenute sono state sottoposte ad elettroforesi su gel di poliacrilammide e saggiate per l’attività biologica (attività proteasica). La purificazione delle frazioni attive è stata effettuata mediante HPLC a fase inversa. La proteina, purificata secondo le procedure descritte in precedenza, è stata, quindi, sottoposta a caratterizzazione strutturale. In primo luogo è stato determinato il peso molecolare accurato mediante spettrometria di massa ad electrospray (ES/MS) che è risultato essere di 27973.2 * 1.5 Da. Successivamente la proteina è stata sottoposta ad idrolisi enzimatica estensiva ed i frammenti peptidici ottenuti, separati mediante HPLC. Alternativamente, la miscela di peptidi è stata analizzata direttamente mediante spettrometria di massa MALDI. I valori di massa ottenuti sono stati utilizzati per una ricerca in banca dati mediante un software opportuno allo scopo di identificare la proteina, se nota, o di evidenziare eventuali omologie con altre proteine a sequenza nota. Si è proceduto inoltre alla determinazione della sequenza amminoacidica N-terminale e alla determinazione della sequenza di qualcuno dei frammenti purificati su HPLC mediante degradazione automatizzata di Edman. Le sequenze ottenute sono state utilizzate ancora per una ricerca in banca dati allo scopo di verificare e confermare i dati ottenuti in precedenza con un metodo che ha consentito una maggiore accuratezza. Risultato di tale ricerca è stato che l'enzima purificato dal veleno di Trimeresurus elegans è una proteina sconosciuta mai studiata in precedenza, con un elevato grado di omologia strutturale con enzimi utilizzati da tempo come farmaci antitrombotici.
La caratterizzazione funzionale ha riguardato il raffronto delle proprietà catalitiche dell'enzima con serina proteasi note come la trombina (l'enzima fibrinogenolitico naturale), la tripsina e la chimotripsina. Il tipo di degradazione apportato alla macromolecola di fibrinogeno dall'enzima consiste nella degradazione delle subunità A* e B*, mentre non viene idrolizzata la catena *. Inoltre l'enzima non è sensibile all'inibizione da parte dei comuni inibitori della trombina umana e non ha effetti sulla aggregazione delle piastrine. L'enzima purificato ha mostrato, infine, possedere un punto isoelettrico pari a 5,1 e un pH ottimale di funzionamento compreso tra 7,4 e 8,0.

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Capitolo Primo - Introduzione 4 1. INTRODUZIONE 1.1 Serpenti velenosi e significato biologico dei loro veleni L’assenza di arti e la pronunciata lunghezza dei loro corpi sono le principali caratteristiche dei serpenti che rappresentano un sottordine della classe dei Vertebrati: i rettili. Si stima che circa i 2/3 di tutte le specie viventi di questi rettili producano secrezioni tossiche in speciali ghiandole poste sotto la mascella superiore. Per comprendere il significato biologico dei loro veleni bisogna sottolineare quanto segue: 1) tutti i serpenti sono carnivori; 2) i serpenti sono costretti ad ingoiare per intero le loro prede, senza avere la possibilità di masticarle; 3) molti serpenti si nutrono relativamente di grandi animali con lunghi intervalli di tempo tra un pasto ed un altro. Questi veleni hanno tre scopi principali: la cattura e quindi l’uccisione della preda, la parziale digestione della preda stessa e un effetto deterrente nel caso di attacchi da parte di altri predatori. I veleni di serpente agiscono in maniera diversa a seconda dell’organismo in cui vengono iniettati; la maggiore azione tossica è sviluppata a carico di quegli animali che costituiscono le prede abituali, conseguenza questa di una perfetta co- evoluzione preda-predatore. Molto probabilmente le componenti proteiche tossiche presenti nei veleni di serpente sono il risultato di un’evoluzione di

Tesi di Laurea

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Ermando Maisto Contatta »

Composta da 87 pagine.

 

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Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.