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Meccanismi molecolari coinvolti nel differenziamento neuronale indotto da Acido retinoico nella linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y

Informazioni tesi

  Autore: Marco Crimi
  Tipo: Tesi di Laurea
  Anno: 1999-00
  Università: Università degli Studi di Milano
  Facoltà: Medicina e Chirurgia
  Corso: Biotecnologie
  Relatore: Giovanni Tredici
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 145

Una letteratura sempre più interessata circa il ruolo di due MAPK, ERK1 e ERK2, nei diversi processi cellulari ha indirizzato il nostro lavoro a valutare l’attivazione di queste molecole nel corso del differenziamento nervoso nella linea cellulare di neuroblastoma umano SHSY5Y (cellule che rappresentano un ottimo modello simil-nervoso), utilizzando l’acido retinoico come agente differenziativo.
Il primo passo è stato quello di valutare la fosforilazione e quindi l’attivazione di ERK1 e ERK2 in seguito a trattamento con acido retinoico, analizzando sia la durata che l’andamento nel tempo di tale attivazione; successivamente si è verificata la relazione esistente tra la concentrazione di acido retinoico impiegata e l’entità della fosforilazione di ERK1 e ERK2.
Allo scopo di individuare le molecole e le vie metaboliche coinvolte nella cascata enzimatica responsabile della fosforilazione di ERK1 e ERK2 indotta da acido retinoico, è stata analizzata l’attivazione di diverse molecole implicate in importanti meccanismi cellulari, sia valutandone lo stato di fosforilazione che mediante l’uso di inibitori specifici.
Gli inibitori PD98059 e U0126 sono stati impiegati per verificare se la fosforilazione di ERK1 e ERK2 ottenuta con acido retinoico, fosse dipendente dall’attività di MEK, enzima unico nel suo genere, responsabile dell’attivazione di ERK1 e ERK2 nel trattamento con fattori di crescita.
MEK, in generale, può essere attivato da diverse protein chinasi, tra cui Raf e PKC. Il coinvolgimento di due isoforme dell’enzima Raf (Raf-1 e B-Raf), in seguito a trattamento con acido retinoico delle cellule SHSY5Y, è stato verificato per mezzo di anticorpi specifici nel riconoscere ciascuna delle due isoforme; mentre in presenza dell’inibitore specifico per la PKC, GF109203X, si è esaminata la fosforilazione sia di MEK che di ERK1 e ERK2.
L’attivazione di MEK, ERK1 e ERK2 è stata osservata anche in seguito a trattamento con Wortmannina, inibitore selettivo del PI3K, enzima in grado di attivare la PKC.
Infine sono stati valutati la localizzazione intracellulare di ERK1 e ERK2 una volta attivate con acido retinoico e il ruolo dell’attivazione di queste molecole nel differenziamento neuronale delle cellule di neuroblastoma umano SHSY5Y: utilizzando l’allungamento del neurite come indicatore per l’avvenuto differenziamento, si è determinata la percentuale di cellule differenziate dopo 24h di trattamento con acido retinoico in presenza di specifici inibitori della fosforilazione delle chinasi studiate.

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4 SCOPO DEL LAVORO Una letterarura sempre più interessata circa il ruolo di due MAPK, ERK1 e ERK2, nei diversi processi cellulari ha indirizzato il nostro lavoro a valutare l’attivazione di queste molecole nel corso del differenziamento nervoso nella linea cellulare di neuroblastoma umano SHSY5Y (cellule che rappresentano un ottimo modello simil-nervoso), utilizzando l’acido retinoico come agente differenziativo. Il primo passo è stato quello di valutare la fosforilazione e quindi l’attivazione di ERK1 e ERK2 in seguito a trattamento con acido retinoico, analizzando sia la durata che l’andamento nel tempo di tale attivazione; successivamente si è verificata la relazione esistente tra la concentrazione di acido retinoico impiegata e l’entità della fosforilazione di ERK1 e ERK2. Allo scopo di individuare le molecole e le vie metaboliche coinvolte nella cascata enzimatica responsabile della fosforilazione di ERK1 e ERK2 indotta da acido retinoico, è stata analizzata l’attivazione di diverse molecole implicate in importanti meccanismi cellulari, sia valutandone lo stato di fosforilazione che mediante l’uso di inibitori specifici. Gli inibitori PD98059 e U0126 sono stati impiegati per verificare se la fosforilazione di ERK1 e ERK2 ottenuta con acido retinoico, fosse dipendente dall’attività di MEK, enzima unico nel suo genere, responsabile dell’attivazione di ERK1 e ERK2 nel trattamento con fattori di crescita. MEK, in generale, può essere attivato da diverse protein chinasi, tra cui Raf e PKC. Il coinvolgimento di due isoforme dell’enzima Raf (Raf-1 e B-Raf), in seguito a trattamento con acido retinoico delle cellule SHSY5Y, è stato verificato per mezzo di anticorpi specifici nel riconoscere ciascuna delle due isoforme; mentre in presenza dell’inibitore specifico per la PKC, GF109203X, si è esaminata la fosforilazione sia di MEK che di ERK1 e ERK2.

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Parole chiave

acido retinoico
colture cellulari
differenziamento
fosforilazione
lita
mapk
neuriti
neuroni
staminali
western blot

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