Acidi mercapturici nelle urine come biomarcatori di esposizione ad agenti genotossisi

Il presente lavoro di ricerca è stato incentrato sullo sviluppo di metodiche analitiche volte alla quantificazione degli acidi mercapturici urinari di soggetti professionalmente esposti a benzene e stirene. In particolare, sono stati considerati l’acido S-fenilmercapturico, quale coniugato glutationico del benzene, e gli acidi M1-R, M1-S, M2-R e M2-S (PHEMAS), per l’esposizione a stirene. L’analisi si è avvalsa di tecniche di Gas Cromatografia accoppiata alla Spettrometria di Massa a singolo stadio e tandem, GC/MS e GC/MS-MS, e Cromatografia Liquida ad Alte Prestazioni accoppiata alla Spettrometria di Massa a singolo stadio e tandem, LC-MS e LC-MS/MS.
Nel corso del primo anno si è proceduto alla caratterizzazione degli analiti mediante tecniche di GC/MS e LC/MS, utilizzando strumenti con analizzatore a trappola ionica.
Nel corso del secondo anno è stata affrontata la problematica relativa all’utilizzo di un opportuno standard interno nelle analisi quantitative. Si è proceduto alla sintesi di due analoghi strutturali dell’acido S-fenilmercapturico, gli acidi p-Bromo- e p-Cloro-fenilmercapturico (p-Br-S-PMA e p-Cl-S-PMA). Dall’analisi dei risultati, l’acido p-Br-S-PMA è risultato più puro ed è, quindi, stato utilizzato quale standard interno.
È stata successivamente affrontata la problematica riguardante l’estrazione degli analiti dalla matrice biologica, paragonando diverse tecniche di estrazione alla luce delle percentuali di recupero e della necessità di contenere i tempi dell’analisi. Campioni urinari sono stati estratti mediante cromatografia liquido/liquido (L/L), estrazione in fase solida (Solid Phase Extraction, SPE) utilizzando cartucce a scambio anionico (Strong Anionic Exchange, SAX), e mediante HPLC/UV con colonne C18 in fase inversa. L’analisi ha evidenziato che l’estrazione mediante HPLC rappresenta la migliore tecnica di estrazione sia perché assicura la più alta percentuale di recupero degli analiti sia perché permette di contenere i tempi e i costi della purificazione.
Si è proceduto, quindi, alla costruzione di rette di calibrazione per l’S-PMA e i PHEMAS in GC/MS e LC/MS, valutando la linearità della risposta, il limite di rivelabilità ottenibile, i tempi ed i costi complessivi dell’analisi, al fine di scegliere la migliore tecnica analitica. I risultati hanno evidenziato che l’analisi LC/MS con analizzatore a trappola ionica è la tecnica più conveniente, visto che consente di ottenere un limite di rivelabilità inferiore rispetto alla GC/MS, non è necessario derivatizzare gli analiti, con conseguente riduzione dei tempi e dei costi dell’analisi.
Nel corso del terzo anno l’analisi LC/MS è stata ulteriormente migliorata avvalendosi di uno spettrometro con analizzatore a triplo quadrupolo, che ha permesso di ottenere un limite di rivelabilità inferiore e una migliore riproducibilità delle analisi rispetto allo spettrometro LC/MS con analizzatore a trappola ionica. degli analiti all’interno dello spettrometro e poi mediante analisi LC/MS. Per l’S-PMA si è proceduto alla valutazione dei parametri statistici mediante analisi di varianza dei risultati ottenuti per campioni di controllo qualità.
Il metodo analitico sviluppato è stato applicato alla quantificazione dei livelli di acido S-fenilmercapturico in campioni di urina di soggetti fumatori non professionalmente esposti a benzene.
Infine, si è proceduto al monitoraggio dell’esposizione professionale a benzene in un deposito carburanti della città di Napoli. Sono stati raccolti campioni di urina di inizio e fine turno lavorativo di 11 soggetti (fumatori e non), che sono stati invitati a rispondere ad un questionario, al fine di ottenere informazioni circa lo stile di vita e le specifiche mansioni lavorative, informazioni utili nell’interpretazione dei risultati. I campioni di urina sono stati divisi in aliquote ed analizzati per quantificarne i livelli di acido S-fenilmercapturico e benzene urinari: per entrambi i biomarcatori si è registrato un incremento dei livelli degli analiti nei campioni di fine turno rispetto a quelli di inizio turno. Inoltre, gli andamenti dei livelli di S-PMA e benzene urinario ottenuti sono concordanti, sottolineando la validità di entrambi i biomarcatori per l’analisi dell’esposizione professionale a benzene.