Interazione pianta-patogeno: caratterizzazione in vitro e in vivo di poligalatturonasi prodotte da Botrytis cinerea

stato vegetativo, si organizzano a formare strutture dette sclerozi in cui sono strettamente 
aggregate quasi a formare degli pseudoparenchirni. Ife più o meno ramificate possono 
insieme formare miceli che a loro volta si presentano come strutture non settate 
polienergidiche o come insieme di ife settate trasversalmente. In quest'ultimo caso le ife 
presentano differenti tipi di apparati settali considerati caratteri distintivi nelle varie Classi 
di Ascorniceti e Basidiorniceti. 
A livello cellulare (ife) gli Eumiceti sono caratterizzati nell'avere una parete rigida che 
può essere di natura cellulosica (Oomiceti) o chitinosa (tutti i Funghi superiori) 
presentante anche glucani e proteine. Nei casi in cui non si conosce la riproduzione 
sessuale dei funghi o perche l'hanno persa nel corso dell'evoluzione oppure non è ancora 
stata scoperta, i funghi sono defmiti come "funghi imperfetti" e appartengono alla classe 
Deuteromycetes.  
La maggior parte di funghi appartenenti a questa classe sono Ascomiceti, ma in tutto sono 
presenti circa 25000 specie. In questo caso la classificazione dei funghi è fatta in base alle 
modalità di formazione dei conidi che attualmente è analizzata con l'aiuto della 
microscopia elettronica a trasmissione e a scansione. (Raven et al. cap.11,1976; Gerola, 
1995) 
 
 
1.1.1 Riproduzione e diffusione del fungo 
 
Nei Funghi la riproduzione può essere vegetativa, 
sessuale e per sporogonia.  
La riproduzione vegetativa può avvenire per scissione, 
gemmazione, frammentazione e sporulazione con la 
formazione di mitospore.  
In particolare negli Ascomiceti, Deuteromycetes, si ha 
la formazione di esospore dette conidi che si vengono a 
formare per lo spezzettamento di un'ifa in tante 
neutrospore, fig. 1. 
 
La forma, la posizione dei conidi e delle ife che li producono e li portano (ife condiofore 
o conidiofori) hanno grande importanza per il riconoscimento e la classificazione delle 
varie specie. I conidiofori, infatti, possono essere isolati oppure riuniti in fascetti detti 
coremi o sinnemi, oppure essere riuniti in ammassi particolari di ife detti stromi che 
formano superfici appiattite acervuli, o formano strutture simili a fiaschi dette picnidi, la 
cui porzione basale è ingrossata e tappezzata da conidiofori, fig. 2. 
 
 
 
 
Con la sporulazione si vengono a formare delle spore durature che a differenza dei 
conidi, hanno una parete molto spessa, sono prodotte in numero minore e sono ricche di 
sostanze di riserva.  
La riproduzione sessuale invece si trova nelle specie superiori con la formazione di 
quattro spore aploidi per meiosi (sporogonia) a partire da una unica cellula ed è molto 
diffusa negli Ascomiceti e Basidiomiceti. 
Negli Ascomiceti questo tipo di riproduzione è caratterizzata dalla produzione di 
meiospore all'interno di un cellula particolare detta asco. Nei Basidiomiceti invece le 
meiospore sono portate alI'esterno della cellula detta basidio, analoga all'asco. Con la 
riproduzione sessuale si può inoltre avere sia la produzione di gameti identici sia di 
gameti morfologicamente e fisiologicamente diversi. 
 
 
1.2 Il fungo Botrytis cinerea 
 
Botrytis cinerea (Botrytis) è un patogeno vegetale capace di infettare più di 200 specie di 
piante (Jarvis, 1977), in qualsiasi stadio di crescita e in qualsiasi parte della pianta (Elad e 
Evensen 1995), provocando seri danni alle coltivazioni e ai raccolti. 
Botrytis fa parte del gruppo deuteromycete (Hyphomycete) (Cooper et al., 2000) e come 
tutti i funghi "imperfetti" manca della riproduzione sessuale. 
Generalmente si trova sotto forma di micelio su residui vegetali lesionati o in fase di 
senescenza. 
In condizioni ambientali sfavorevoli Botrytis può produrre forme di resistenza dette 
sclerozi che hanno la funzione di conservare il micelio allo stato vegetativo (Elad e 
Evensen, 1995).  
Condizioni di alta umidità e temperatura invece permettono al fungo di produrre uno 
strato grigio-bianco di ife e strutture fruttifere sopra il tessuto colpito. Questi corpi 
fruttiferi sono formati da conidiofori che appaiono trasparenti o pigmentati e sono 
deputati alla formazione di mitospore dette conidi, fig. 3. 
  
 
Fig.3 Immagini dei conidiofori di Botrytis cinerea. 
 
a) conidiofori pigmentati visti allo stereoscopio, portanti spore all'estremità ( Æ ). 
b) struttura di un conidioforo e spore di lunghezza 14 µm.  
c) conidioforo visto al microscopio ottico portante spore all'estremità ( Æ ). 
Immagini provenienti dal sito: 
(www.orst.eduldeptJbotany/epp/guide/glossary/index). 
 
I conidi, una volta formatisi, sono liberati nell'aria permettendo così la diffusione del 
fungo. Una volta raggiunto l'ospite, i conidi vanno incontro a germinazione solo in 
presenza di acqua e nutrienti (Elad e Evensen, 1995). Con la germinazione si ha la 
formazione di tubi germinativi e appressoria che sono delle ife modificate, delimitate da 
setti con cui il fungo penetra nell'ospite (Clark e Lorbeer, 1976), vedi fig. 4. 
 
Fig. 4 Sezione trasversale di foglia di cipolla infettata con 
Botrytis cinerea. A livello istologico si vede come il 
fungo produce l'appressorium (a) e l'ifa di infezione (ih) 
all'interno della parete cellulare (w) dell'epidermide; due 
modi con CUI Il fungo penetra nell' ospite. 
(e) lume della cellula epidermica  
(ct) cuticola e 
 
Sia l'appressorium sia il tubo germinativo in seguito alla loro formazione, secemono una 
matrice extracellulare costituita da carboidrati, lipidi e proteine, per garantire una forte 
adesione del patogeno alla pianta (Cooper et al., 2000). 
La penetrazione nell'ospite avviene abitualmente attraverso gli storni o la cuticola ma 
anche attraverso delle lesioni se sono presenti. Bisogna precisare che se la penetrazione 
avviene attraverso gli storni non si ha la formazione di appressoria ma solo del tubo 
germinativo, (Clark e Lorbeer, 1976). 
Da alcuni studi è stato visto che la germinazione e la crescita superficiale del fungo è 
stimolata dalla presenza di etilene, la cui produzione è attribuita alla pianta in seguito 
all'attacco del patogeno (Elad e Evensen, 1995).  
E’ noto che alcuni funghi patogeni possono produrre delle sostanze come prodotto di un 
metabolismo inattivo o a funzione ignota che invece possono essere degli ormoni per le 
piante (Gerola, 1995). Ad esempio l'etilene presente nella pianta in seguito all'attacco di 
Botrytis cinerea è attribuito alla pianta in quanto non ci sono evidenze che sia prodotto 
dal fungo (Elad e Evensen, 1995). 
Il tessuto infettato con Botrytis cinerea appare ricoperto da un manto di micelio e spore 
che danno la malattia comunemente chiamata "muffa grigia".  
I sintomi più comuni della malattia sono l'appassimento del fiore, il marciume dei frutti, 
nonche il cancro dello stelo, macchie e ruggine nelle foglie, e il marciume del bulbo e del 
tubero, fig. 5, (www.cse.uga.edu/Agriculture/plantpath/plantdis/fungi/Botrytis.html) 
 
  
 
 
1.2.1 Ruolo delle poligalatturonasi fungine nell'interazione pianta-patogeno 
 
Negli ultimi trent'anni la ricerca sulla patologia delle piante si è focalizzata 
sull'identificazione degli enzimi extracellulari implicati nella patogenicità del fungo.  
Fra questi, gli enzimi degradanti la parete cellulare, CWDEs (cell wall degrading 
enzymes), hanno suscitato un certo interesse in quanto sono implicati nel degradazione 
della parete vegetale, permettendo al fungo di attaccare l'ospite (Wubben et al., 1999). 
Alcuni lavori descrivono la secrezione dei CWDEs durante le prime fasi di infezione 
suggerendo un loro coinvolgimento nella penetrazione dell'ospite (ten Have et al., 1998). 
 
Al gruppo dei CWDEs appartengono diversi enzimi fra cui: la pectin-metil esterasi, la 
pectin liasi, cellulasi e le poligalatturonasi (Wubben et al., 1999). 
Le poligalatturonasi sono delle glicoproteine distinte in eso- ed endo- poligalatturonasi 
secondo l'azione di degradazione della pectina presente nella parete vegetale. Le 
esopoligalatturonasi scindono la pectina di omogalatturonani liberando unità di acido 
galatturonico a partire dall'estremità della catena, mentre le endopoligalatturonasi 
degradano la pectina scindendo anche i legami fra una unità e l' altra di acido 
galatturonico che si trovano alI' interno della catena, fig. 6. 
 
 
1.2.2 Le poligalatturonasi prodotte da Botrytis cinerea 
 
Come tutti i funghi Botrytis cinerea è un organismo eterotrofo ( organotrofo ) capace di 
nutrirsi per demolizione esterna dei substrati, attraverso esoenzimi e per successivo 
assorbimento delle soluzioni (Gerola, 1995). 
Le poligalatturonasi sono enzimi prodotti dal fungo per la demolizione di substrati 
utilizzati come fonte di carbonio. In particolare l'azione di questi enzimi portano alla 
degradazione della lamella mediana, parte ricca di sostanze pectiche della parete della 
cellula vegetale, con conseguente lisi e morte cellulare; caratteristiche queste dello 
sviluppo della malattia. 
Finora sono stati identificati fmo a 13 differenti isoforme di poligalatturonasi (Van der 
Cruyssen et al., 1994). Il peso molecolare delle poligalatturonasi prodotte da Botrytis 
cinerea varia da 23 kDa (Leone et al. , 1990) a 45 kDa (Tobias et al., 1995) secondo il 
loro grado di glicosilazione nonche della loro sequenza aminoacidica (Wubben et al., 
1999).