Meccanismi di immuno-regolazione: PARP-1 svolge ruoli opposti nel differenziamento delle cellule Th2 e T regolatorie

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1. INTRODUZIONE 
 
1.1. La famiglia PARP 
La poliADP-ribosilazione è una modificazione post-traduzionale di proteine nucleari coinvolte 
nella regolazione di importanti processi fisiologici, come il mantenimento dell'integrità 
genomica, la replicazione e la trascrizione del DNA e la morte cellulare. Consiste in una 
reazione reversibile catalizzata dalla poliADP-ribosio polimerasi (PARP) che, a partire dal 
NAD
+
, permette il trasferimento di unità di ADP-ribosio su specifiche proteine bersaglio e la 
formazione di polimeri di ADP-ribosio (PAR) lineari o ramificati (D‟Amours et al., 1999). 
Tale attività polimerasica è stata identificata in molti organismi eucarioti, dai funghi ai 
mammiferi (eccetto i lieviti S. cerevisae e S. pombe) ma anche in archeobatteri, eubatteri e 
virus a DNA doppio filamento (Hassa et al., 2006). 
Nell‟uomo la famiglia delle proteine PARP è costituita da 18 membri. Sebbene la funzione e 
la struttura di ognuno di essi non sia del tutto nota, per almeno cinque di loro sono state 
studiate le proprietà biochimiche ed enzimatiche: PARP-1 (113 kDa), PARP-2 (62 kDa), 
PARP-3 (60 kDa), PARP-4 (193 kDa), e PARP-5 o Tankyrasi 1 (142 kDa). Di questi, quello 
maggiormente studiato è PARP-1, un abbondante enzima nucleare coinvolto nella risposta 
cellulare al danno al DNA provocato da stress genotossico (Peralta-Leal et al., 2009). 
 
1.1.1. La struttura di PARP-1 
Nell‟uomo il gene PARP-1 si trova sul cromosoma 1q41-42 e la sua proteina è costituita da 
1014 amminoacidi (aa), per un peso molecolare di 116 kDa. PARP-1 è una proteina molto 
abbondante: 0.2-2.0 x 10
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 molecole per cellula (in media 1.0x10
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 molecole per cellula) 
(D‟Amours et al., 1999; Ludwig et al., 1988; Yamanaka et al., 1988). 
PARP-1 ha un‟ organizzazione modulare in cui si possono evidenziare tre diversi domini 
funzionali: un dominio ammino-terminale, contenente il sito di legame al DNA (DBD), un 
dominio centrale di automodificazione, un dominio carbossi-terminale, che lega il substrato ed 
è responsabile dell'attività catalitica dell'enzima. 
Il DBD è compreso tra gli aa 1-373, contiene due motivi a dita di zinco (FI e FII) che agiscono 
come sensori della lesione nel DNA (Langelier et al., 2008), due motivi ad elica-giro-elica 
essenziali per il legame nel DNA (D‟Amours et al., 1999), ed una sequenza di localizzazione 
nucleare (NLS). All‟interno della sequenza NLS è presente il motivo DEVD, sit o bersaglio 
delle caspasi 3 e 7 (Meyer-Ficca et al., 2005).
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Il dominio di automodificazione si trova tra i residui 374 e 525; esso funziona come sito 
accettore primario di poliADP-ribosio grazie alla presenza di 15 residui di glutammato 
(Cherney et al., 1987; D‟Amours et al., 1999; Kawaichi et al., 1981; Uchida et al., 1987). E‟ 
presente, inoltre, un modulo BRCT, responsabile delle interazioni proteina-proteina. 
Recentemente  è stato identificato un motivo a cerniera di leucine coinvolto nella 
dimerizzazione di PARP e nella sua interazione con altre proteine (D‟Amours et al., 1999; 
Hassa and Hottiger, 2008). 
Il dominio catalitico si estende tra i residui 526 e 1014. L‟ attività enzimatica viene 
completamente abolita se si eliminano gli ultimi 45 aa al C-terminale di questo dominio. I 
residui tra le posizioni 859 e 908 rappresentano una sequenza catalitica denominata “PARP 
signature”, altamente conservata filogeneticament e e presente in tutti i membri della famiglia 
PARP; dagli studi finora condotti emerge che questa sequenza è identica in tutti i vertebrati 
(omologia del 100%). Il sito attivo di questo dominio presenta un motivo strutturale a β -α-
loop-β-α responsabile del legame al NAD
+
 (D‟Amour et al., 1999; Ruf et al., 1998).  
 
1.1.2. Poli-ADP ribosilazione 
Il poliADP-ribosio (pADPr) è un omopolimero, lineare o ramificato, in cui le unità di ADP-
ribosio sono unite attraverso legami glicosidici ribosio-ribosio1″-2′ (D‟Amour et al., 1999). I 
livelli costitutivi del polimero sono generalmente molto bassi e in assenza di danni al DNA le 
unità di ADPr sulle proteine accettrici si trovano in forma di mono o oligo-ADPr. In presenza 
di danni al DNA, o di stimoli descritti più avanti, l‟attività di PARP e i livelli dei polimeri di 
ADPr aumentano dalle 10 alle 500 volte (Simonin et al., 1993). 
La sintesi di questo omopolimero richiede il NAD
+
 come precursore o substrato immediato 
della reazione: in seguito all‟idrolisi del NAD
+
, avviene il rilascio del nicotinammide e di 
ADP-ribosio, quest‟ultimo viene legato attraverso un legame estere sul gruppo γ -carbossilico 
di residui di glutammato o aspartato presenti in specifiche proteine bersaglio; in questo modo 
avviene la mono ADP-ribosilazione del substrato. In seguito, PARP catalizza le reazioni di 
allungamento e ramificazione del polimero, utilizzando unità addizionali di ADPr sempre 
derivanti dal NAD
+
. Si generano così nuovi legami ribosio-ribosio e la formazione di polimeri 
con una lunghezza approssimativa di 200 unità di ADPr e numerosi punti di ramificazione 
(una ogni 20-50 unità di ADPr) (D‟Amour et al., 1999; Diefenbach and Burkle, 2005). 
Studi in vivo e in vitro hanno identificato più di 30 substrati proteici di PARP, la maggior parte 
dei quali sono proteine nucleari coinvolte nel metabolismo degli acidi nucleici e nel
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mantenimento della struttura della cromatina. PARP-1 stessa funziona da accettore subendo in 
questo modo una  reazione di automodificazione, che altera le sue proprietà di legame.  
PARP-1 è soggetto a diverse modificazioni covalenti post-traduzionali: parilazione, 
acetilazione, fosforilazione, ubiquitinazione e sumoilazione. La parilazione da parte dello 
stesso PARP-1, di PARP-2 e probabilmente anche da parte di altri membri PARP, inibisce la 
sua capacità di legame al DNA e l‟attività catalitica (D‟Amours et al., 1999) e, di 
conseguenza, comporta il rilascio di PARP-1 dalla cromatina (Kim et al., 2004). La 
fosforilazione di PARP-1 da parte di ERK1/2 sulla Ser372 e Thr373 è richiesta per 
l‟attivazione dell‟enzima in seguito a danno del DNA ( Kauppinen et al., 2006). L‟acetilazione 
di PARP-1, inizialmente osservata nella regolazione trascrizionale dipendente da NF- B, 
avviene grazie alle acetiltransferasi p300/CBP e PCAF (Hassa et al., 2005). Anche 
sumoilazione e ubiquitinazione possono modulare il ruolo di PARP-1 come regolatore della 
struttura cromatinica e della trascrizione (Martin et al., 2009; Wang et al., 2008). 
L‟aggiunta dei polimeri di ADP-ribosio sugli accettori proteici ne altera le proprietà fisiche, 
biochimiche e l‟affinità di legame al DNA; questi cambiamenti permettono alle proteine 
modificate di interagire con la poliADP-ribosio glicoidrolasi (PARG), deputata all‟idrolisi dei 
polimeri (Davidovic et al., 2001; Diefenbach and Burkle, 2005). 
La proteina PARG media un rapido ricambio dei polimeri di ADP-ribosio. Essa possiede sia 
un‟attività endoglicosidasica che esoglicosidasica, responsabili dell‟idroli si dei legami 
glicosidici tra le unità di ADP-ribosio localizzati, rispettivamente, all‟interno de l polimero e 
alla sua estremità (D‟Amours et al., 1999). A livello fisiologico è di notevole importanza 
l‟attività endoglicosidasica, che genera molecole di p oliADP-ribosio, ipotizzati essere rilevanti 
nei processi di morte cellulare (Hong et al., 2004; Meyer-Ficca et al., 2005).  
Inoltre, è stata purificata e caratterizzata una proteina liasi responsabile dell‟idrolisi del 
monomero di ADP-ribosio prossimale alla proteina bersaglio. Una volta liberate, le unità di 
ADPr vengono catabolizzate in AMP e ribosio-5-fosfato dalle ADPr pirofosfatasi (Oka et al., 
1984).  
 
1.1.3. Ruolo nella riparazione del DNA e nell’apoptosi 
Molti degli studi pubblicati su PARP-1 sottolineano la proprietà di questo enzima di rilevare le 
interruzioni sul DNA, comportandosi da coattivatore enzimatico durante vari processi 
fisiologici e patologici.  
Il legame covalente dei pADPr alle proteine è considerato una risposta biochimica immediata 
e drastica al danno indotto da ossidazione, alchilazione e radiazioni ionizzanti. PARP-1 è in
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grado di legare il DNA danneggiato a livello delle interruzioni a singolo o doppio filamento, 
funzionando così da “sensore del danno”. Se il danno non è esteso, P ARP-1 agisce come 
fattore di sopravvivenza, rilevando il danno e favorendone il riparo; in caso contrario 
promuove la morte cellulare. PARP-1 è coinvolto in numerosi processi di riparo, tra cui 
single-strand breaks (SSBs), double-strand breaks (DSBs) e base excision repair (BER) 
(Burkle, 2001). PARP-1 interagisce fisicamente e funzionalmente con varie proteine coinvolte 
in questi processi e recluta le proteine deputate alla riparazione nel sito del danno, come la 
DNA ligasi III e il fattore XRCC1. PARP-1 interagisce in modo cooperativo anche con PARP-
2 in alcuni di questi processi (Huber et al., 2004; Jagtap and Szabò, 2005; Nguewa et al., 
2005). 
In presenza di un esteso danno al DNA la sintesi eccessiva dei PAR da parte di PARP-1 può 
promuovere la morte cellulare attraverso l‟apoptosi o attraverso la via necrotica, come 
conseguenza della carenza cellulare di NAD
+
 e di ATP (Bouchard et al., 2003; Decker and 
Muller, 2002; Kim et al., 2005). Questo meccanismo è presente in svariate condizioni 
patofisiologiche, come nel danno da ischemia/riperfusione e in situazioni infiammatorie 
(Diefenbach and Burkle, 2005; Virag and Szabo, 2002). Durante il processo apoptotico, 
PARP-1 viene processata dalla caspasi-3 a livello del dominio NLS (Diefenbach and Burkle, 
2005). Questo evento proteolitico blocca l‟attivazione di PARP -1 in risposta alla 
frammentazione del DNA, proteggendo le cellule dal consumo di ATP e dalla successiva 
necrosi. Di recente è stato riportato che anche PARG è bersaglio della caspasi-3 sul dominio 
catalitico (Kim et al., 2005), a sostegno del concetto che un accurato controllo del sistema di 
poliADP-ribosilazione è indispensabile per l‟esecuzione della morte cellulare programmata e 
per l‟eliminazione di cellule irrevocabilmente danneggiate (Affar et al., 2001). PARP-1 viene 
processato anche durante la piroptosi, un programma di morte cellulare che avviene in seguito 
all‟attivazione della caspasi -1 nel complesso dell‟inflammasoma (Malireddi et al., 2010).  
L‟abbondante poliADP -ribosilazione indotta in seguito a lesioni del DNA in cellule non 
proliferanti, può promuovere l‟apoptosi caspasi -indipendente, provocando il rilascio del fattore 
pro-apoptotico AIF (apoptosis-inducing factor) dai mitocondri al nucleo, dove induce la 
condensazione della cromatina e la frammentazione del DNA (Diefenbach and Burkle, 2005; 
Kim et al., 2005). Inoltre, come mostrato di recente (Yang et al., 2010), l‟espressione del 
fattore anti-apoptotico BCL2 diminuisce quando i livelli di PARP-1 sono molto elevati, e 
aumenta quando viene ridotta l‟espressione del gene PARP-1.  
In condizioni in cui l‟integrità del genoma viene mantenuta, PARP è in grado di regolare 
l‟espressione genica in risposta a stimoli biologici, chimici e fisici attraverso due meccanismi:
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la modulazione della struttura della cromatina e l‟ interazione diretta con fattori di trascrizione 
(Schreiber et al., 2006). PARP-1 può essere reclutato a livello dei promotori o di ehnancer 
interagendo con proteine che legano il DNA o riconoscendo specifiche strutture e sequenze del 
DNA (Kraus and Lis, 2003). In alcuni casi l‟attività enzimatica di PARP -1 è richiesta per 
regolare la trascrizione. Ad esempio, la poliADP-ribosilazione di alcuni fattori di trascrizione 
come YY1 e TBP inibisce il loro legame al DNA (Hassa and Hottiger, 2002). Inoltre la 
poliADP-ribosilazione degli istoni altera la struttura della cromatina (Tanuma et al., 1985) e 
rende i geni più accessibili al macchinario di trascrizione. I principali istoni bersaglio per 
PARP-1 e PARP-2 sono rispettivamente H1 e H2B. In altri casi, PARP-1 può funzionare come 
un coattivatore trascrizionale anche in assenza del dominio catalitico e della capacità di legare 
il DNA. Nel caso del fattore di trascrizione NF- B, PARP-1 ne regola l‟attività attraverso 
diversi meccanismi. La poli-ADP ribosilazione di NF- B ne riduce l‟interazione con 
l‟esportina Crm1 e promuove l‟interazione di NF - B nel nucleo (Zerfaoui et al., 2010). 
Inoltre, indipendentemente dalla sua attività enzimatica, PARP-1 svolge la funzione di scaffold 
necessaria per l‟attivazione trascrizionale mediata da NF - B (Hassa et al., 2001; Kraus and 
Lis, 2003). 
  
1.1.4. Ruolo nell’infiammazione 
Le risposte immunitarie ed infiammatorie inducono numerosi adattamenti fisiologici nel 
tentativo di ridurre il danno tissutale e rimuovere l‟insulto patogenico. La loro regolazione è 
un processo fisiologicamente complesso ed è molto importante sia per l‟omeostasi che per la 
sopravvivenza dell‟organismo. L‟inibizione far macologica o l‟eliminazione di PARP -1 
fornisce protezione verso il danno tissutale associato a patologie correlate a stress ossidativi tra 
cui infarto, diabete, shock settico indotto da LPS, artrite reumatoide, colite e dermatiti. Questi 
effetti benefici sono correlati con l‟inibizione dei processi di morte e la ridotta espressione di 
citochine infiammatorie e altri mediatori (Viràg, 2005a). 
Il fattore di trascrizione NF- B è attivato da LPS, citochine (IL-1, TNF- α) e stress ossidativo; 
PARP-1 può interagire con NF- B e favorire la trascrizione di molti geni coinvolti 
nell‟infiammazione, tra cui citochine, come TNF-α, IL -1, IL-6, IFN-γ e CCL3 , e la forma 
inducibile dell‟ossido nitrico sintasi (iNOS) ( Hassa et al., 2003; Huang et al., 2008). PARP-1 
svolge un doppio ruolo nel danno tissutale indotto dall‟infiammazione. In caso di ischemia, la 
riperfusione induce dei danni ossidativi attraverso la formazione di specie reattive 
dell‟ossigeno e dell‟azoto. Questi eventi conducono all‟attivazione di PARP-1 che, se è 
eccessiva, induce una carenza di energia cellulare, cui segue la morte delle cellule e il danno
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tissutale (Hassa et al., 2001). Dall‟altra parte, nelle cellule che sopravvivono, l‟attivazione di 
PARP-1 è in grado di orientare la trascrizione verso un profilo pro-infiammatorio, favorendo 
la produzione delle citochine menzionate.     
 
1.1.5. Ruolo nell’immunità adattativa 
Studi recenti hanno mostrato che PARP-1 svolge un ruolo anche nella risposta adattativa, 
regolando la capacità delle cellule dendritiche di stimolare le cellule T (Aldinucci et al, 2007) 
o influenzando le funzioni e il differenziamento delle cellule T e B. Durante l‟attivazione delle 
cellule T, PARP-1 regola le funzioni di NFAT (Nuclear Factor of Activated Cells) (Olabisi et 
al., 2008; Valdor et al., 2008) e modula l‟espressione delle citochine Th1/Th2 ( Saenz et al., 
2008). 
La famiglia dei fattori di trascrizione NFAT ha un ruolo importante nel differenziamento e 
nelle funzioni delle cellule T (Saenz et al., 2008). L‟attivazione di NFAT è re golata da eventi 
di fosforilazione e defosforilazione: l‟attività fosfatasica della calcineurina, determina la 
traslocazione di NFAT nel nucleo e il suo legame al DNA; mentre la fosforilazione di NFAT 
nel nucleo ne induce il trasferimento nel citoplasma. Durante la stimolazione delle cellule T, 
PARP-1 lega NFAT e lo ADP-ribosila. Secondo gli studi di Valdor et al. (Valdor et al., 2008), 
inibendo PARP-1 si riscontra un aumento nella transattivazione dipendente da NFAT e un 
ritardo nei meccanismi di esportazione nucleare. Invece, secondo Olabisi et al. (Olabisi et al., 
2008), la poliADP-ribosilazione aumenta la capacità di NFAT di legare il DNA e nelle cellule 
PARP-1 KO si osserva una ridotta espressione delle citochine IL-2 e IL-4. 
Diverse evidenze mostrano che la mancanza di PARP-1 altera l‟espressione di molti geni 
durante l‟attivazione delle cellule T (Valdor et al., 2008). Gli autori hanno osservato che, 
rispetto alle cellule stimolate con solo anti-CD3, in quelle costimolate con anti-CD3 e anti-
CD28 il numero di geni positivamente regolati da PARP-1 è maggiore, mentre è minore il 
numero di quelli modulati negativamente. La stimolazione delle cellule T naïve dipendente dal 
TCR, riprodotto con l‟uso dell‟anti -CD3, è sufficiente per attivare NFAT, ma può indurre uno 
stato di non responsività importante per l‟induzione della tolleranza immunologica. Invece, 
l‟ulteriore presenza di segnali costimolatori, instaura la piena attivazione delle cellule, la 
produzione di citochine e la proliferazione cellulare. L‟integrazione dei segnali provenienti dal 
TCR e da molecole costimolatorie permette l‟attivazione di NFAT e NF - B a diversi livelli 
(Gatta et al., 2002; Pioli et al., 1999) e sta alla base della “decisione” delle cellule di 
rispondere o no agli antigeni riconosciuti dal TCR. Come detto precedentemente, PARP-1