Ricostituzione del macchinario mitocondriale dell'import nei liposomi

  
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2  Introduzione 
 
 
 
 
I mitocondri sono degli organelli subcellulari costituiti da due 
membrane, la membrana interna e quella esterna, che delimitano la 
matrice e lo spazio intermembrane. Questi organelli contengono un 
proprio genoma ed un macchinario di sintesi proteica nel 
subcompartimento più interno, la matrice mitocondriale. La maggior 
parte delle proteine mitocondriali, tuttavia, è codificata dal DNA 
nucleare e sintetizzata a livello citosolico. Il DNA mitocondriale, 
infatti, è in grado di codificare soltanto 13 proteine, ossia meno del 
2% delle proteine presenti nei mitocondri. 
 Le proteine neosintetizzate a livello dei polisomi citosolici, 
denominate preproteine, sono trasportate in uno dei quattro 
subcompartimenti mitocondriali, membrana esterna, spazio 
intermembrane, membrana interna e matrice, mediante un processo
  
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molto complesso che si compone di varie tappe. Il trasporto di queste 
proteine ai mitocondri richiede l'intervento di uno specifico 
"macchinario dell'import", costituito da varie proteine presenti 
all'interno e all'esterno dei mitocondri [1-4].  
Le preproteine sono caratterizzate da specifici segnali nelle loro 
sequenze amminoacidiche che ne guidano il trasferimento ai 
mitocondri (targeting) e lo smistamento al giusto subcompartimento 
(sorting). Tali segnali possono essere presenti come estensioni 
amminoacidiche amminoterminali, denominate presequenze, oppure 
possono trovarsi all'interno della sequenza della proteina matura ed in 
tal caso sono denominati segnali di import interni.  
Le presequenze sono generalmente costituite da 15-30 amminoacidi e 
sono caratterizzate da una prevalenza di residui di arginina e di 
amminoacidi idrossilati che conferiscono, quindi, una carica netta 
positiva [5, 6]. Esse sono inoltre in grado di formare nelle membrane 
  
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delle α-eliche anfipatiche. La funzione di targeting mitocondriale 
svolta da tali sequenze amminoacidiche è stata determinata costruendo 
delle proteine di fusione costituite dall'unione della presequenza con 
proteine citosoliche [7-9].  
Molte preproteine non contengono presequenze ma segnali di import 
interni; anche questi sono caratterizzati da residui carichi 
positivamente che, probabilmente, formano sequenze anfipatiche [10]. 
In Fig. 1 è riportato il percorso seguito dalle preproteine durante 
il trasporto nei mitocondri. Il trasferimento di entrambi i tipi di 
preproteine, sia quelle dotate di presequenza, sia quelle con segnali 
interni di import, è mediato da fattori citosolici che mantengono le 
proteine in una conformazione import-competente e ne prevengono 
l'aggregazione [11, 12]. Tali fattori citosolici, chiamati chaperon, 
permettono l'interazione delle preproteine con i costituenti del 
complesso TOM (TOM= translocase of outer membrane).
  
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Il complesso TOM è formato da almeno 8 proteine diverse organizzate 
a formare due subcomplessi recettoriali, Tom20/Tom22 e 
Tom70/Tom37, e un canale attraverso cui transitano le preproteine 
[13]. Il subcomplesso Tom20/Tom22 è coinvolto nel riconoscimento 
della maggior parte delle preproteine, in particolare di quelle dotate di 
presequenza, o delle proteine della membrana mitocondriale esterna 
[14]. La presequenza stabilisce con il dominio citosolico di Tom22 
un'interazione di tipo ionico mentre il legame con Tom20 sembra 
avere carattere idrofobico [15].  
Il subcomplesso Tom70/Tom37 è coinvolto nel riconoscimento delle 
proteine che presentano segnali interni di targeting. Il dominio 
solubile della Tom70 presenta una specifica affinità per le proteine 
appartenenti alla famiglia dei carrier mitocondriali, come il carrier 
ADP/ATP, che possiedono questo tipo di segnali [16]. Avvenuta 
l'interazione con Tom70, la preproteina è probabilmente trasferita
  
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all'altro subcomplesso recettoriale Tom20/Tom22 che, quindi, assume 
un ruolo centrale nel processo di import [17]. 
Dopo il riconoscimento da parte dei sistemi recettoriali, entrambi i tipi 
di preproteine transitano attraverso un canale comune nella membrana 
esterna denominato GIP (GIP= general import pore). Esso è costituito 
da Tom40, che forma la parte centrale e fondamentale del canale, da 
Tom22, che abbiamo visto avere anche una funzione recettoriale, 
nonché da altre tre piccole proteine, Tom5, Tom6 e Tom7 [18]. Tom5 
rappresenta l'anello di connessione tra i sistemi recettoriali e il GIP 
[19], mentre Tom6 e Tom7 modulano la dinamica del complesso 
svolgendo delle funzioni tra loro antagoniste [20, 21].  
Giunte a livello dello spazio intermembrane le preproteine possono 
seguire percorsi differenti a seconda della loro destinazione definitiva: 
quelle destinate alla membrana mitocondriale interna e alla matrice 
interagiscono con il complesso TIM (TIM= translocase of the inner 
  
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membrane). Il subcomplesso Tim17/Tim23 è coinvolto nell'import 
delle proteine dotate di presequenza. A tale complesso è associata 
Tim44, una proteina periferica della membrana mitocondriale interna 
che sporge nella matrice [22]. Essa fornisce un'ancora di membrana 
per una proteina chaperon di matrice, mtHsp70, la cui attività è ATP-
dipendente [23]. mtHsp70 permette la completa traslocazione delle 
preproteine attraverso le membrane esterna ed interna dei mitocondri 
facilitando l'unfolding dei domini proteici che si trovano ancora sul 
lato citosolico [24].  
Infine, la maturazione proteolitica della preproteina avviene ad opera 
di una specifica peptidasi, chiamata MPP o matrix processing 
peptidase. Durante o dopo il processo proteolitico, le proteine 
neoimportate assumono la loro conformazione attiva e funzionale in 
seguito all'azione di particolari chaperon, come mtHsp70, Hsp60 e 
vari co-chaperon [25-29]. 
  
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La traslocazione delle preproteine attraverso la membrana 
mitocondriale interna necessita di un potenziale di membrana negativo 
all'interno, dal lato della matrice.  Il potenziale di membrana esplica il 
suo effetto o inducendo una variazione conformazionale nel 
macchinario TIM, o esercitando un effetto elettroforetico sulle 
sequenze cariche positivamente delle proteine [30, 31]. Il potenziale di 
membrana è necessario anche per l'import delle proteine che 
presentano segnali interni di targeting, le quali seguono un percorso 
differente da quello precedentemente descritto per le proteine con 
presequenza. Le proteine prive di presequenza presentano 
generalmente carattere idrofobico ed il loro passaggio attraverso lo 
spazio intermembrane è permesso da piccole proteine Tim presenti in 
questo subcompartimento acquoso dei mitocondri. Queste ultime, 
infatti, mediano il trasferimento delle proteine idrofobiche dal 
complesso TOM ad un subcomplesso differente da Tim17/Tim23, 
  
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denominato Tim22/Tim54. La proteina in transito, riconosciuta da tale 
complesso, è probabilmente smistata, per semplice diffusione laterale, 
nella membrana mitocondriale interna [32]. Esperimenti effettuati con 
vescicole di membrana mitocondriale interna hanno dimostrato che il 
complesso TIM può operare indipendentemente dal complesso TOM. 
Tali vescicole, infatti, possono importare precursori proteici con la 
stessa efficienza e con le stesse caratteristiche dei mitocondri intatti 
[33]. 
Nonostante tutti gli studi riportati in precedenza, i meccanismi 
molecolari di trasferimento delle preproteine attraverso le membrane 
mitocondriali non sono ancora noti in dettaglio. Per ottenere maggiori 
informazioni su tali meccanismi, il macchinario di inserzione delle 
proteine mitocondriali è stato analizzato nei suoi singoli costituenti, 
alcuni dei quali sono stati purificati con successo e caratterizzati 
strutturalmente e funzionalmente.  
  
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La Tom40 è stata recentemente overespressa nei batteri e ricostituita 
nei liposomi [34]. Il complesso TOM purificato è risultato inserito 
nelle vescicole artificiali con lo stesso orientamento che esso possiede 
nella membrana mitocondriale esterna. Tale complesso, inoltre, è stato 
in grado di promuovere l'inserzione delle proteine della membrana 
esterna e di mediare la traslocazione sia delle proteine dello spazio 
intermembrane che di quelle con presequenza dirette alla matrice. 
Studi elettrofisiologici hanno dimostrato che i proteoliposomi 
contenenti il complesso TOM purificato presentano un canale selettivo 
per i cationi con un poro di circa 22 angstrom che consente la 
traslocazione delle preproteine in una conformazione estesa o ad α-
elica [35].  
Oltre al complesso TOM anche il macchinario di traslocazione della 
membrana mitocondriale interna è stato ricostituito nei liposomi. 
Secondo quanto riportato da Haucke e Schatz [36], le vescicole di
  
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membrana interna sono state solubilizzate in presenza di colato e di 
lipidi mitocondriali di lievito; la successiva rimozione del detergente 
mediante dialisi ha permesso la formazione dei proteoliposomi. Le 
vescicole ricostituite hanno presentato una composizione proteica 
simile alle vescicole di membrana interna e sono risultate in grado di 
inserire le proteine di membrana nella loro giusta locazione.  
A differenza del processo di traslocazione delle proteine attraverso il 
reticolo endoplasmico o attraverso la membrana batterica [37], 
l'import delle proteine destinate alla matrice o alla membrana 
mitocondriale interna richiede la presenza di un potenziale 
elettrochimico a livello di quest'ultima.  
L'utilizzo del clorato di sodio è un metodo per generare un potenziale 
di membrana indipendente dall'attività della catena respiratoria. La 
generazione di tale potenziale elettrochimico è dovuta alla diffusione 
differenziale dell'anione clorato, permeabile alla membrana,
  
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e del catione sodio, impermeabile alla stessa [38]. Questo potenziale è 
stato applicato sia alle vescicole ricostituite, sia alle vescicole di 
membrana interna; in entrambi i casi esso si è rivelato necessario per il 
corretto import delle proteine della membrana mitocondriale interna, 
come AAC e Tim23 [36]. Inoltre, in questi esperimenti, è stato 
dimostrato che il processo di import di tali proteine non sembra 
richiedere la presenza di Tim44 o mtHsp70, la cui attività ATP-
dipendente è necessaria per la completa traslocazione delle proteine 
dirette alla matrice. E' da sottolineare, inoltre, che l'import di AAC 
nelle vescicole di membrana interna è risultato meno efficiente che nei 
mitocondri intatti; questo risultato probabilmente è da ascriversi 
all'assenza di fattori citosolici o dello spazio intermembrane, che 
consentono un più efficiente processo di import delle proteine nei 
mitocondri [36].  
In definitiva, gli studi finora effettuati riguardanti la ricostituzione
  
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del macchinario mitocondriale dell'import hanno fornito soltanto dei 
risultati preliminari, ma di grande interesse, per la comprensione dei 
complessi fenomeni molecolari connessi alla biogenesi mitocondriale. 
 Il lavoro sperimentale da me effettuato ha riguardato la 
ricostituzione del macchinario mitocondriale dell'import di 
Saccharomyces cerevisiae nei liposomi. Abbiamo pertanto cercato di 
mettere a punto una metodica sperimentale efficiente in grado di 
consentire questo tipo di studio. Le vescicole ricostituite, secondo le 
nostre condizioni sperimentali, sono state utilizzate per testare 
l'import, in un sistema artificiale, di alcune proteine mitocondriali 
sintetizzate in vitro.