Ruolo della fosfolipasi C in radici di riso sottoposte a stress anaerobico

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alcaloide da Ryania speciosa) non influenzava minimamente l�accumulo di 
GABA indotto da anossia, mentre l�inibizione avveniva con Rosso Rutenio 
400 µ M, un inibitore del rilascio di Ca
2+ 
da comparti intracellulari. 
L�applicazione durante l�anaerobiosi di inibitori della PLC, Neomicina e 
composto 48/80 (C48/80), in scala di concentrazione crescente, dava come 
risultato una inibizione dell�accumulo anaerobico di GABA 
rispettivamente a concentrazioni ≥ 2 mM per la Neomicina e ≥ 100 mM per 
quanto riguarda il C48/80. L�accumulo di GABA veniva ripristinato 
dall�aggiunta di CaCl
2 
2 mM
 
e A23187 (Ca
2+
 ionoforo) 10 µ M. Questo 
ristabilirsi dell�accumulo di GABA dopo trattamento con CaCl
2 
indica che 
gli inibitori della PLC agiscono a monte del rilascio intracellulare di Ca
2+
. 
Se i germogli venivano pretrattati per due ore in condizioni aerobiche con 
AlF
4
- 
(un attivatore delle proteine G), questi mostravano un aumento 
dell�accumulo anaerobico di GABA del 43% rispetto a radici anaerobiche 
di controllo. L�accumulo di GABA in germogli pretrattati con AlF
4
- 
200 
µ M
 
era fortemente inibito dall�aggiunta di Neomicina o C48/80. E� stato 
poi determinato il livello di inositolo1,4,5-trifosfato (IP
3
) in radici di 
germogli di riso sottoposti a trattamento anaerobico.  Il livello aerobico di 
IP
3 
era di 33,7 pmoli g
-1
 di peso fresco e aumentava nei primi minuti di 
stress anaerobico. Dopo 5 minuti il livello di IP
3 
era 3,5 volte quello in aria 
e quindi cominciava a diminuire rimanendo comunque pi� alto che in aria 
(+64%). Il livello di IP
3
 � stato poi esaminato a 5 minuti di anaerobiosi 
dopo pretrattamenti con Neomicina, C48/80, AlF
4
-  
(200 µ M), Ca
2+ 
(2mM), 
AlF
4
-
+Neomicina, AlF
4
-
+C48/80, AlF
4
-
+Ca
2+
. Entrambi gli inibitori della 
PLC inibivano l�aumento anaerobico di IP
3
, mentre la stimolazione delle 
proteine G mediante AlF
4
-
, induceva un aumento di concentrazione di IP
3
 
 7
fino ad un livello superiore a quello anaerobico. Quest�ultimo effetto era 
completamente annullato da Neomicina o da C48/80. La presenza di Ca
2+
 
riduceva la concentrazione di IP
3
 a livelli osservati in aria in radici 
anaerobiche trattate con AlF
4
-
.  
L�insieme di questi dati indica che la PLC agisce sulla via di 
trasduzione del segnale anaerobico in radici di riso. La PLC opererebbe a 
valle delle proteine G e il suo prodotto, l�IP
3
, � probabilmente il 
messaggero secondario coinvolto nel rilascio di Ca
2+
.  
 10
 
INTRODUZIONE 
 
Risposta allo stress anaerobico nelle piante superiori. 
 
Pur essendo la disponibilit� di acqua un fattore essenziale per la 
sopravvivenza in tutte le piante superiori, un eccesso in corrispondenza 
dell�apparato radicale pu� causare seri danni o addirittura risultare letale a 
causa della riduzione del trasferimento di O
2
 tra il suolo e l�atmosfera. A 
causa di allagamenti episodici, drenaggio lento o in zone umide naturali, le 
radici delle piante possono accusare una deficienza di O
2
 in quanto 
l�apporto di O
2
 ad un tessuto dipende dalla sua concentrazione e diffusione 
nel mezzo circostante e quest�ultima � circa 10000 volte pi� bassa in acqua 
che in aria, quindi le radici si trovano a passare da condizioni aerobiche ad 
un ambiente prevalentemente anaerobico. 
La presenza di ossigeno � fondamentale per garantire e sostenere i 
processi di respirazione, principale fonte energetica di un organismo, in cui 
l�ossigeno interviene come accettore terminale nella via di trasporto degli 
elettroni lungo i citocromi (processo strettamente associato alla 
fosforilazione dell�ADP a dare ATP).  
La mancanza di ossigeno, in condizioni ambientali, porta ad un 
potenziale redox molto negativo del terreno e all�accumulo di specie 
ridotte come NO
2-
, Mn
2+
, Fe
2+
, H
2
S e intermedi del metabolismo microbico 
come acido acetico e acido butirrico. In alcune condizioni, questi soluti 
possono accumularsi a livelli tossici.   
 
 11
Le varie specie di piante superiori differiscono in modo rilevante nella 
loro tolleranza allo stress anossico: le radici di alcune specie molto 
sensibili (ad es. Triticum aestivum) non riescono a sopravvivere che poche 
ore, mentre le radici di specie pi� resistenti (ad es. Oryza sativa), 
sopravvivono qualche giorno. La capacit� di tollerare una condizione 
anossica pu� dipendere non solo dalla specie ma anche dallo stadio di 
crescita, dal tessuto coinvolto e dal periodo dell�anno in cui si verifica la 
condizione di stress (durante l�inverno il metabolismo � ridotto ad uno 
stato di dormienza) (Crawford, 1982). 
 
I tessuti che vengono maggiormente colpiti dallo stress anossico 
sembrano essere le radici, in quanto perdono velocemente la capacit� di 
assorbire acqua, ioni e nutrienti dal terreno; questo viene seguito da una 
ridistribuzione di metabolitinel floema verso tessuti in crescita e la 
senescenza precoce del tessuto fogliare. Parallelamente, a causa del 
mancato assorbimento radicale di acqua, si osserva una caduta del 
potenziale idrico cellulare (Crawford, 1982).  
 
   Tutte le cellule vegetali sono in grado di sopravvivere a periodi di 
anossia di circa 1 ora, anche se in alcuni casi molto di pi�. Normalmente, 
in cellule metabolicamente molto attive, il contenuto di ATP � sufficiente 
per 1-2 minuti (Roberts et al., 1984a; Roberts et al., 1984b). Il 
metabolismo anaerobico deve quindi contribuire alla sopravvivenza 
permettendo la rigenerazione di ATP. 
A livello subcellulare, i primi effetti a carico del mitocondrio 
(ingrossamento e scomparsa delle creste) sono visibili gi� dopo alcuni 
 12
minuti di anossia (Andreev et al., 1991), ma sono rapidamente recuperati 
con la reintroduzione di O
2
, assieme a un ugualmente rapido recupero del 
metabolismo energetico fino a livelli normossici. I danni alla struttura 
mitocondriale, al metabolismo energetico e alla vitalit� risultano 
irreversibili solo dopo 15 ore di anossia. Il danneggiamento e la morte 
delle radici sono stati attribuiti all�accumulo di prodotti tossici del 
metabolismo anaerobico, alla riduzione del metabolismo energetico, o alla 
mancanza di substrati per la respirazione.  Per pi� di un decennio, la 
ricerca si � concentrata sul fatto che la morte cellulare in anossia � 
strettamente associata all�acidificazione del citoplasma. Da esperimenti 
effettuati su apici radicali di mais, mediante osservazioni non invasive 
[
31
P- e 
13
C-NMR (Roberts et al., 1992; Rivoal e Hanson, 1994; Saint-Ges 
et al., 1991)], si � osservato che il pH citoplasmatico (7,3-7,4) mostrava 
una precoce diminuzione, attribuita ad una iniziale produzione di acido 
lattico. Dopo circa 20 min., il pH rimaneva stabile a 6,8, in corrispondenza 
di un cambiamento nella fermentazione: veniva sintetizzato etanolo 
piuttosto che acido lattico. Questa variazione � dovuta al fatto che pH<7 
inibiscono la LDH e attivano la PDC. 
 
   Una seconda fase, coincidente con la morte, era dovuta alla perdita di 
protoni dal vacuolo (inizialmente a pH 5,8) causata dalla mancanza di 
energia per il funzionamento delle H
+
-ATPasi tonoplastiche e dalla 
conseguente perdita passiva di protoni dal comparto vacuolare verso il 
citoplasma. L�acidosi citoplasmatica � cos� vista come un fattore 
determinante la morte cellulare. 
 13
 Esperimenti su Oryza sativa evidenziarono che l�anossia causava una 
iniziale caduta del pH citoplasmatico da pH 7,4 a pH 7,0, seguita da una 
parziale ri-alcalinizzazione sia del citoplasma sia del vacuolo. In radici di 
Triticum aestivum, intolleranti all�anossia, il pH decresceva continuamente 
da 7,4 a 6,6 senza manifestare seguente ripresa. La regolazione del pH � 
quindi fondamentale per la sopravvivenza. 
In condizioni anossiche si ha una rilevante fermentazione lattica, ma 
l�acidosi del citoplasma in cellule di riso e frumento non pu� essere 
attribuita alla sola produzione di lattato. Una ulteriore considerazione � che 
la produzione di acido lattico potrebbe essere meno dannosa per la vitalit� 
di quanto finora supposto. Molto dell�acido lattico � infatti rilasciato nel 
mezzo. Una produzione sostenuta di acido lattico e una esportazione verso 
il medium esterno � stata misurata in radici di mais (Mac Alpine, 1995). La 
fermentazione lattica non � necessariamente dannosa: infatti il lattato 
formato e i protoni possono essere trasportati alla soluzione esterna. Inoltre 
pu� essere significativo il fatto che in mais la LDH � inducibile 
dall�anossia (Good e Paetaku, 1992; Hondred e Hanson, 1990) (Fig. 1). 
 
L�interesse verso l�etanolo come possibile causa della morte cellulare 
durante l�anossia � diminuito con l�evidenza che, per interferire con il 
metabolismo, ne � necessario un ingente accumulo. Inoltre, essendo 
solubile nel doppio strato lipidico, l�etanolo pu� facilmente diffondere al 
di fuori dei tessuti, nel medium circostante dove � diluito o metabolizzato 
da microrganismi. Prove del danno conseguente alla trasformazione di 
etanolo in acetaldeide sono state ottenute da cellule di carote in 
sospensione (Perata et al., 1992).