Ruolo della modulazione del recettore mineralcorticoide nella differenziazione adipocitaria: potenziali ricadute sulla sindrome metabolica.

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1.  INTRODUZIONE 
 
1.1 Il recettore mineralcorticoide 
Il recettore mineralcorticoide (MR) è il principale effettore della risposta cellulare ai 
mineralcorticoidi. Esso è stato a lungo considerato un recettore dei glucocorticoidi 
(GR) secondario, non a caso i due recettori sembrano discendere dalla duplicazione 
genica di uno stesso recettore corticosteroide ancestrale, il quale risultava essere già 
preadattato per l’attivazione da parte dell’aldosterone, che però si è evoluto milioni di 
anni dopo. Dopo la duplicazione, che quindi genera MR e GR, si verificano due 
sostituzioni nella sequenza di GR le quali sono fondamentali per spiegare la diversa 
responsività all’aldosterone dei due recettori.  
MR è un membro della superfamiglia dei recettori nucleari e, in quanto tale, presenta 
tre domini funzionali: 
1. dominio N-terminale o dominio A/B 
2. domino di legame per il DNA o DBD 
3. dominio C-terminale o LBD ( dominio di legame per il igando)
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Fig.1:  
Il recettore mineralcorticoide è un recettore nucleare. Rappresentazione schematica 
della struttura di questo recettore e struttura dei tre domini funzionali. 
 
 
Il dominio A/B contiene una sequenza detta AF-1 in grado di attivare la trascrizione. 
In poche parole AF-1 interagisce i coattivatori della trascrizione. 
Il dominio di legame per il DNA è costituito da 66 amminoacidi ed è la regione che 
caratterizza tutti i recettori nucleari. Comprende un complesso di due gruppi di 4 
cisteine che si avvolgono intorno a due atomi di Zn
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a costituire il cosiddetto modello 
a dita di zinco, che in realtà forma α-eliche, di cui una si inserisce nel solco maggiore 
del DNA, prendendo contatti con una sequenza specifica detta elemento di risposta 
all’ormone, si tratta di una sequenza palindromica di 11-15 nucleotidi. 
Il dominio D è una regione di collegamento ed è un elemento variabile tra i diversi 
recettori nucleari.
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Il dominio LBD risulta essere molto conservato
 
(Fagart J, Huyet J et al, 2005), 
sebbene vi sia anche una significativa variazione di sequenza. Si riconoscono, in tale 
dominio, 12 α eliche numerate da 1 a 12: H1-H12. H3, H5 e H6 concorrono a 
delimitare la cavità idrofobia in cui alloggia il ligando (molecola altamente liofila). 
Questo dominio contiene:  
 un sito di legame per il ligando 
 un dominio di attivazione AF-2 che interagisce con i coattivatori della 
trascrizione in modo ligando-dipendente (a differenza di AF-1 che lega i 
coattivatori anche in assenza di ligando. 
 Un dominio di dimerizzazione 
 Un segnale NLS (segnale di localizzazione nucleare) 
 Un sito per l’interazione con HSP 56, HSP 70 e HSP 90. 
Il dominio F nn è presente in tutti i recettori nucleari e nn gli è ancora stata attribuita 
alcuna funzione. 
L’MR, in assenza di ligando, è mantenuto in una struttura trascrizionalmente inattiva 
dal complesso HSP presente nel citoplasma. Il legame del ligando determina una 
modificazione conformazionale che rende il recettore, traslocato nel nucleo, 
trascrizionalmente attivo. La struttura cristallina del LBD umano
 
(Fagart J et al, 2005; 
Bledsoe RK et al, 2005; Li Y et al, 2005) rassomiglia molto a quella di GR, del 
recettore per gli androgeni e per il progesterone. Il dominio LBD di MR consiste di 11 
α-eliche e di 4 foglietti β ripiegati in un sandwich tristratificato. 
Il dominio N-terminale, sebbene sia altamente conservato nelle diverse specie, è poco 
conservato nella superfamiglia dei recettori nucleari. Recentemente è stata identificata 
un’interazione ligando-dipendente tra il dominio N-terminale e LBD: l’interazione 
N/C.
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Nell’attivazione dei recettori per gli steroidi sono coinvolte diverse molecole: 
coregolatori, coattivatori, e corepressori
 
(Glass CK et al, 2000). Kitagawa e i suoi 
collaboratori
 
(Kitagawa H et al, 2002) hanno trovato che la coattivazione di MR e di 
una elicasi che interagisce con il dominio N-terminale di MR, è necessaria solo in 
presenza di aldosterone e non di cortisolo (glucocorticoide naturale). Questa 
osservazione indica un inaspettato grado di plasticità del recettore che fa si che la 
conformazione sia in parte dettata dal ligando. 
Studi in vitro hanno evidenziato come MR abbia la stessa affinità di legame sia per i 
MC sia per i GC (cortisolo)
 
(Krozowski ZS et al, 1983; Myles K et al, 1994), mentre 
in vivo MR esprima maggiore specificità di legame per l’aldosterone, nonostante il 
cortisolo raggiunga concentrazioni plasmatiche da 100 a 1000 volte maggiori rispetto 
al MC. Tale specificità in vivo sembra essere conferita:  
1. dalla presenza di proteine di legame (“glucocorticoid-binding protein” ed 
albumina) che permettono solo al 10% del cortisolo di passare liberamente le 
membrane cellulari
 
(Funder JW, Feldman D et al, 1973). 
2. dalla presenza nei tessuti bersaglio dell’enzima 11β HSD2, il quale, converte il 
cortisolo nella sua forma biologicamente inattiva, cortisone, incapace di 
legarsi al MR e di esplicare quindi la sua attività mineralcorticoide
 
(Funder 
JW, Pearce PT et al, 1988). 
L’MR è fondamentalmente espresso nei tessuti cellulari polarizzati, quali neurone 
distale, colon e dotti salivari, dove regola l’omeostasi salina attraverso il controllo 
dell’espressione dei suoi geni target. 
 Il riassorbimento del sodio è guidato da un meccanismo accoppiato di canali ENaC 
(epithelial sodium channel) sodio epiteliali posti a livello apicale e da una pompa 
Na/K ATPase basolaterale ed è regolato essenzialmente da una kinasi, sgk1, regolata
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dal siero e dai glucocorticoidi. Quindi una volta che l’aldosterone si è legato al MR 
inattivo nel citoplasma, esso trasloca nel nucleo e si lega agli elementi di risposta 
all’ormone situati nella regione di regolazione del promotore del gene target.  
Nella parte distale del nefrone del rene, l’MR induce l’espressione del gene per sgk1 
che attiva una cascata di reazioni le quali permettono l’assorbimento di sodio e di 
acqua attraverso ENaC e l’escrezione di potassio con conseguente ipertensione. 
Quindi i canali epiteliali del sodio amiloride-sensibili (ENaC) rappresentano il 
principale punto di controllo del flusso di sodio.  
I canali ENaC sono costituiti da tre subunità: α, β e γ e si trovano nella parte distale 
del colon, nel tubulo distale e nel dotto collettore del rene, nelle ghiandole salivari e 
nel dotto escretore delle ghiandole sudoripare. Sebbene l’espressione delle tre  
subunità siano regolate dai corticosteroidi in modo tessuto-specifico, questo non è il 
principale meccanismo attraverso cui l’aldosterone regola l’attività di ENaC
 
(Tait JF 
et al, 1961). La regolazione dell’attività di ENaC è importante per aumentare il 
numero di canali inseriti nella membrana plasmatica o per aumentare il tempo della 
loro apertura. Il turnover di ENaC è mediato da una ubiquitin protein ligasi: Nedd4-2
 
(Pardridge WM et al, 1981; Katagama S et al, 1982) 
Nella sindrome di Liddle (pseudoipoaldosteronismo), le mutazioni nel dominio C-
terminale delle subunità β o γ di ENaC inibiscono la sua interazione con Nedd4-2 
perciò i canali vengono rimossi dalla membrana molto lentamente
 
(Williams GH et al, 
1983). Al contrario di quanto accade nella sindrome da eccesso di MC, la sindrome di 
Liddle non risponde al blocco di MR; il gene Nedd4-2 non è regolato dall’aldosterone
 
(Melby JC, 1973) ma la sua attività è modulata dalla fosforilazione da parte della 
kinasi regolata dal siero e dai GC: sgk-1
 
(Pardridge WM et al, 1981)
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L’espressione e la funzionalità dell’ MR si estende anche alle cellule non epiteliali 
quali l’ippocampo, i neuroni ipotalamici, i cardiomiociti e gli adipociti. La 
disregolazione del sistema MC rivela il suo ruolo cruciale nelle diverse patologie 
umane quali resistenza mineralcorticoide
 
(Zennaro MC, Lambès M, 2004), disordini 
nel sistema nervoso
 
(De Kloet ER et al, 1998), ipertensione
 
(Lifton RP et al, 2001) e 
danni cardiaci. Recentemente è stato descritto un ruolo pro-infiammatorio non 
epiteliale per l’attivazione di MR, mediante studi basati sulla somministrazione di 
mineralcorticoidi in esperimenti su animali e studi clinici quali RALES e EPHESUS. 
Questi meccanismi sono stati descritti nei cardiomiociti e nelle cellule muscolari 
vascolari, in cui MR può essere attivato in modo inappropriato dall’aldosterone nel 
contesto di uno stadio di eccessivo carico salino. Nello studio RALES, basse dosi di 
spironolattone (analogo dell’aldosterone con cui compete a livello recettoriale) 
aggiunte alle terapie standard per l’insufficienza cardiaca, migliora la sopravvivenza 
del 30% nella prevenzione degli attacchi ischemici, nella risposta infiammatoria 
renale e coronarica in seguito all’attivazione di MR
 
(Pitt B, 2004). L’inattivazione
 
(Berger S et al, 1998; Beggah AT et al, 2002) o l’over-espressione
 
(Le Menuet D et 
al, 2001) di MR nel modello murino conferma il ruolo cruciale svolto da questo 
recettore nelle funzioni renali e cardiache.  
Un’importante scoperta che deriva dagli studi sull’espressione di MR è che il 
recettore non è selettivo per il ligando. Infatti sia l’aldosterone che i glucocorticoidi 
legano MR con la stessa alta affinità. Le concentrazioni plasmatiche degli ormoni GC 
sono 100-1000 volte più alte rispetto a quelle dell’aldosterone (0,1-1 nM).  
La larga prevalenza degli ormoni GC nel plasma potrebbe condurre alla saturazione 
dei MR, determinando un riassorbimento massimale di sodio e precludere il ruolo 
regolatorio specifico dell’aldosterone. Ciò però non è assolutamente compatibile con
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l’azione fisiologica, ben conosciuta, dell’MC aldosterone; si è cercato quindi di capire 
come questo ormone potesse agire in modo selettivo sulle cellule bersaglio. I maggiori 
progressi per la comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari sono emersi solo 
negli ultimi anni. È interessante come ciascuno di questi meccanismi possa essere 
influenzato dal contesto cellulare.  
 
1.2 Selettività del sistema mineralcorticoide 
L’aldosterone circola principalmente in forma libera mentre gli elevati livelli di 
glucocorticoidi plasmatici che arrivano alle cellule target dei mineralcorticoidi sono in 
parte ridotti dal loro legame all’albumina e alla globulina: per questa ragione solo il 
10% del cortisolo è libero nel plasma. Diversi studi hanno dimostrato che l’enzima 
11β-idrossisteroide deidrogenasi (11βHSD) gioca un ruolo critico nel prevenire 
l’eccesso di glucocorticoidi nelle cellule (Edwards CRW et al, 1988; Funder JW et al, 
1988). L’enzima appartiene alla piccola famiglia delle deidrogenasi alcoliche, e la sua 
isoforma responsabile della protezione di MR è la 11βHSD2 che è stata clonata e 
caratterizzata funzionalmente (Agarwal AK et al, 1994; Oppermann VCT et al, 1997). 
Diverse cellule bersaglio dell’aldosterone esprimono la 11βHSD2 che trasforma i 
glucocorticoidi (cortisolo nell’uomo e corticosterone nei topi) nei loro metaboliti 
inattivi (cortisone nell’uomo e 11 deidrocorticosterone nei topi) e ha una debole se 
non nulla affinità per MR (così come per GR). Nelle cellule che coesprimono il 
recettore MR e l’enzima 11βHSD2 (Bonvalet JP et al, 1990)  non è possibile 
l’occupazione permanente di MR da parte dei glucocorticoidi, tuttavia è possibile un 
legame concentrazione-dipendente dell’aldosterone all’ MR e la conseguente 
regolazione del riassorbimento del sodio.
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Fig 2: 
attività dell’enzima 11βHSD2 
 
 
Fig. 3: 
attività dell’enzima 11βHSD2 
 
 
 L’attività catalitica dell’enzima 11βHSD2 è stata inizialmente caratterizzata da 
Bonvalet et al.
 
(Bonvalet JP et al, 1990); l’elevata attività è presente nel tubulo distale, 
dotto collettore e tutti i dotti collettori lungo il rene di ratto. Piccole variazioni di 
questo pattern di espressione si riscontrano in diverse specie, come ratti, conigli e
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uomini. Dopo l’identificazione delle due forme molecolari dell’11βHSD (11βHSD1, 
un’ossidoreduttasi NADP dipendente; 11βHSD2 una deidrogenasi NAD dipendente),  
è apparso che la forma enzimatica responsabile della selettività di MR (11βHSD2) è 
ristretta al neurone distale mentre quello prossimale esibisce l’attività dell’11βHSD1
 
  
(Rusvai E, Naray-Fejes-Toth A, 1993). Le cellule tubulari esprimano non solo MR 
(nefrone distale), ma esprimono anche alti livelli di  11βHSD2, permettendo l’azione 
selettiva dell’aldosterone. 
Il ruolo prevalente dell’enzima 11βHSD2 è correlato a situazioni cliniche in cui 
l’enzima è inattivo
 
(White PC et al, 1997), a causa di mutazioni (sindrome di eccesso 
apparente di mineralcorticoidi: AME) o a causa di inibitori (acido glicirrico, un 
derivato della liquirizia): i pazienti mostrano ipertensione, ipokaliemia e bassi livelli 
di renina e aldosterone nel plasma. Queste caratteristiche cliniche sono dovute 
all’occupazione permanente  di MR da parte dei glucocorticoidi endogeni. 
Recentemente, è stato generato un modello murino affetto da AME mediante 
l’inattivazione del gene che codifica per l’enzima  11βHSD2. Il topo mancante 
dell’enzima (11βHSD2-/-) sviluppa un’ipertensione marcata, ipokaliemia, poliuria 
ipotonica, una drammatica soppressione dell’attività plasmatica della renina e dei 
livelli dell’aldosterone
 
(Kotelevtsev Y et al, 1999). Inaspettatamente, questo fenotipo 
non è stato osservato nei topi eterozigoti (11βHSD2 +/-), differentemente dalle 
mutazioni inattivanti umane dell’11βHSD2 che producono la sindrome AME. 
Si sa poco in merito alla regolazione dell’enzima 11βHSD2; tuttavia, alcune 
regolazioni sono soprattutto di interesse fisiopatologico, in quanto queste 
modulerebbero i glucocorticoidi circolanti che attraverserebbero questo filtro di 
selettività in modo da  legarsi ai recettori corticosteroidi. L’incubazione di dotti 
collettori isolati con arginina-vasopressina (AVP) determina una stimolazione
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dell’attività catalitica dell’11βHSD2 (attraverso il pathway della protein kinasi A: 
PKA). Molto interessante è che in vitro l’effetto in acuto di AVP sull’11βHSD2 è 
stato osservato solo nei tubuli originatesi da ratti adrenalectomizzati trattati in vivo 
con aldosterone (48 ore), mentre il fenomeno era assente quando i ratti erano trattati 
con corticosterone o con desametasone per lo stesso periodo di tempo
 
(Alfaid N et al, 
1997). Ciò indica che il trattamento cronico con l’aldosterone modifica lo stato delle 
cellule del dotto collettore che permette la stimolazione AVP dell’attività enzimatica 
dell’ 11βHSD2. Questi dati suggeriscono che l’aldosterone e il pathway della 
vasopressina interagiscono per upregolare 11βHSD2, perciò per rinforzare la 
selettività dei mineralcorticoidi nel dotto collettore. 
 
1.3  Attivazione del recettore mineralcorticoide: l’aldosterone 
L’aldosterone è il principale ormone mineralcorticoide, prodotto dalle cellule della 
zona glomerulosa della corteccia surrenalica.  
Nel 1934 Zwemer e Sullivan
 
(Zwemer RL, Sullivan RC, 1934) suggerivano 
l’esistenza di una “sostanza” prodotta dal corticosurrene capace di influenzare il 
metabolismo cellulare di acqua e sale. Durante la decade che precedette la scoperta 
dell’aldosterone, siti bersaglio di tale ormone furono identificati nelle cellule epiteliali 
di rene, colon, ghiandole sudoripare e salivari (Davis JO, 1965; Davis JO, 1960). 
Inizialmente chiamato “elettrocortina”, in virtù della sua struttura steroidea con un 
gruppo aldeide in posizione 18 e per la sua origine surrenalica, venne successivamente 
rinominato aldosterone, e isolato nel 1953 da Simpson e i suoi collaboratori (Simpson 
SA et al, 1953).