Studi conformazionali di peptidi gastrinici mediante fluorescenza e dicroismo circolare

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Anche un tumore maligno del pancreas, il gastrinoma, e le 
sue metastasi sono sede di produzione di gastrine; anzi, gran 
parte di questi ormoni e’ stata isolata da tessuti affetti da 
questa patologia(2,3). 
La funzione biologica di questi ormoni e’ alquanto 
delineata: l'impulso nervoso per la loro secrezione e’ generato 
dalla presenza di cibo nello stomaco, e la loro azione si attua 
nello stimolo della produzione di enzimi, acqua e sali da parte 
di stomaco e di pancreas, nell'aumento del flusso sanguigno verso 
la mucosa gastrica e nella comparsa delle contrazioni 
peristaltiche, addette al trasporto del bolo attraverso 
l'apparato digerente. Concentrazioni superiori nel sangue danno 
luogo ad effetti di stimolazione dello sviluppo della mucosa 
gastrica, della secrezione di insulina, delle contrazioni di 
cistifellea e utero (5). 
Sono state identificate finora varie forme di gastrine e di 
frammenti gastrinici di origine naturale: 
 
bigbig gastrin (BBG) formata da 104 amminoacidi (6) 
big gastrin (HG-34) formata da 34 amminoacidi 
little gastrin (HG-17) formata da 17 amminoacidi 
mini gastrin (HG-14) formata da 14 amminoacidi 
frammento N-terminale della little gastrin (NT-HG-17) con 
 13 amminoacidi 
frammento N-terminale della big gastrin (NT-HG-34) con 17 
  amminoacidi 
componente I (CI) di dimensioni intermedie fra BBG e HG-34 
tetrapeptide C-terminale (tetragastrina) 
 
 
 6
 
 
Le strutture primarie note delle gastrine sono riportate in fig.1. 
Big, little e mini gastrina sono molecole biologicamente attive, 
e sono state riconosciute in due forme naturali, forma I e forma 
II, che differiscono solo per la presenza di un gruppo O-solfato 
nell'anello fenolico del residuo di tirosina; la presenza di tale 
gruppo non influenza quasi per nulla l'attivita’ biologica 
dell'ormone. 
Si ritiene che una sola sia la gastrina sintetizzata 
dall'organismo (2), e che le altre molecole non siano altro che 
dei metaboliti di questa, peraltro alcuni ancora biologicamente 
attivi: little, mini e tetra sono infatti frammenti C-terminali 
via via piu’ corti (attivi); NT-HG-17 e NT-HG-34 sono frammenti 
N-terminali (inattivi); sono tutti ottenibili dalla big gastrina 
per azione di tripsina e chimotripsina (3). 
Si ipotizza dunque che bigbig gastrina e componente I siano dei 
pre-pro-ormoni, da cui deriverebbe la big gastrin, un pro-ormone 
che per scissione enzimatica con tripsina originerebbe la little 
gastrin, la forma piu’ attiva e in assoluto piu’ abbondante (95% 
circa) presente nell'organismo (2). 
 
 
 
  BBG �  CI � littlegastrin � metaboliti 
 7
 
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Si rammmenta comunque che ben poco si sa delle due molecole più 
grandi, BBG e CI: non sono mai state studiate approfonditamente. 
(Alcuni addirittura ritengono che la BBG non sia che un artefatto 
sperimentale). (7,3) 
L'efficacia biologica non e’ uguale per le varie gastrine, 
ma aumenta con la lunghezza della catena fino alla little, 
presentando una diminuizione con la big gastrina. 
Il frammento più corto in cui sia stato riconosciuto lo 
spettro completo di attività ormonale e’ il tetrapeptide C-
terminale -Trp-Met-Asp-Phe-NH2; al contrario, nessuna attività e’ 
manifestata da alcun frammento privo di questo tetramero(8). 
Sembra dunque logico attribuire l'origine dell'attività biologica 
proprio a questa sequenza, tanto più che alcuni inibitori 
naturali competitivi dell'ormone (colecistochinina (CCK) e 
ceruleina) presentano la stessa porzione C-terminale: il 
recettore, comune a gastrina e inibitore, riconosce quindi questa 
sequenza (5) . 
 
 
   
 
 
 9
Da prove biologiche e’ risultato che la sostituzione di alcuni 
residui amminoacidici nella sequenza non comporta perdita di 
attivita’; in particolare, e’ possibile ottenere la metilammide o 
l'idrazide della Phe, idrogenare completamente l'anello della Phe 
o inserirvi sostituenti in para ( NO2, CH3, OCH3 ), sostituire la 
Met con Nle o Leu, e tutto ciò senza danno. Al contrario, 
l’idrolisi dell'ammide sulla Phe e la manipolazione del residuo 
di Asp comportano la completa perdita di attivita’ (9). 
Sulla base di tali risultati, Morley e Tracy hanno avanzato 
l'ipotesi che Trp, Met, Phe e -NH2 terminale, che possono subire 
modifiche senza danno per l'attivita’ ormonale, facciano parte 
del sito di legame (porzione della molecola che si ancora al 
recettore di membrana), mentre il residuo di Asp costituisca il 
centro attivo, responsabile degli effetti biologici della 
molecola (9,14). 
Rifacendosi alle molecole più grandi, si e’ ipotizzato che 
tutto il resto della catena serva ad aumentare il tempo di 
permanenza in circolo della porzione C-terminale: è stato 
dimostrato infatti che little e big gastrina resistono 
all'attacco dell'amminopeptidasi grazie ai gruppi piroglutammici 
N-terminali e che il tempo di dimezzamento passa nell'uomo da 6' 
a 45' andando da little a big gastrina (10). 
Una seconda ipotesi propone che la sequenza N-terminale 
svolga una qualche funzione per il riconoscimento della molecola 
da parte del recettore di membrana, infine una terza che essa 
costringa la porzione C-terminale ad assumere una "conformazione 
attiva", necessaria per la interazione con il recettore e quindi 
per lo svolgimento della funzione biologica. 
 
 10
 
 
Ampi studi sono stati effettuati per la determinazione della 
conformazione della tetragastrina. Una serie di calcoli teorici 
(11) ha dimostrato che una struttura a minima energia e' un g-turn 
(C7-bend) centrato su un residuo di Asp, mentre gli anelli 
aromatici di Phe e Trp sarebbero disposti sopra il g-turn a 
formare una sorta di "scudo idrofobico". 
 
     g-turn 
 
A conferma di ciò, si e’ calcolato che qualsiasi modifica a 
carico del residuo di Asp destabilizza la struttura, variandone 
l'attività biologica, così come e’ stato osservato 
sperimentalmente. 
In ogni caso, qualsiasi conformazione la molecola assuma, 
essa non viene mantenuta al crescere della catena N-terminale, 
come risulta da misure CD (19). 
Le gastrine assumono, in acqua, una conformazione disordinata, o 
random coil, indipendentemente dalla lunghezza della catena (19). 
In 2,2,2,trifluoroetanolo (TFE), invece, si osservano spettri 
dicroici tipici di strutture ordinate: i risultati sperimentali 
indicano che una catena peptidica via via più lunga nella 
porzione N-terminale comporta un ordinamento sempre maggiore 
della struttura, e, parallelamente all'aumento di struttura 
 11
ordinata, vi è un aumento della attivita’ biologica delle 
molecole (13)(fig. 2). Sembra quindi che la porzione N-terminale 
della gastrina sia essenziale per ottimizzare il messaggio 
ormonale. 
La correlazione tra aumento di attivita’ biologica "in vivo" 
e aumento di ordine strutturale in TFE al crescere della 
lunghezza di catena fa ritenere che la struttura assunta da 
questi ormoni in tale solvente sia biologicamente importante. Va  
inoltre sottolineato che nel caso di little gastrin la 
conformazione assunta in TFE è identica a quella osservata in 
soluzioni acquose contenenti fosfolipidi, che riproducono 
l'ambiente lipofilico delle membrane cellulari, dove sono situati 
i recettori delle gastrine (20). 
Queste conclusioni sono state raggiunte sulla base di studi 
CD mediante l'uso di cinque frammenti sintetici della 
minigastrina a diversa lunghezza di catena nella parte N-
terminale. Le strutture sono riportate in figura 1. 
Sulla base di questi spettri si è avanzata l'ipotesi che, 
negli ormoni superiori, siano presenti un b-turn in corrispondenza 
della sequenza -Ala-Tyr-Gly-Trp-, e un tratto di a-elica 
localizzato nella successione (-Glu-)5  (12). 
Questa ipotesi viene avvalorata da recenti misure effettuate 
mediante spettroscopia NMR, in TFE a diverse temperature, che 
rilevano la presenza di cinque risonanze di protoni ammidici 
della minigastrina caratterizzate da un basso coefficiente di 
temperatura, indicativo della presenza di altrettanti legami 
idrogeno intramolecolari (13,14). 
 12
 
 
  
 
 
 13
 
   
 
 
 
E’ altresì probabile che la catena peptidica N-terminale sia 
impegnata nel legame con ioni calcio; è nota infatti che alcune 
delle azioni fisiologiche delle gastrine dipendano dalla presenza 
di questo metallo. 
Si crede di poter riconoscere nella sequenza (-Glu-)5 almeno 
un sito di legame per il calcio, mentre un secondo sarebbe 
rappresentato dal residuo di Asp nella parte C-terminale. I due 
siti sarebbero  non-equivalenti dal punta di vista della forza di 
legame. In ogni caso, tre sono gli ioni calcio che si legano ad 
una molecola di little e mini gastrina in ambiente di TFE. 
Nessuna interazione, invece, è stata osservata in acqua (15,16). 
 
 
 14
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
       SCOPO DELLA TESI 
 
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Allo scopo di studiare altri sistemi solvente che possano 
riprodurre il piu’ possibile l'intorno dei recettori di membrana, 
ci si e’ proposto uno studio dettagliato dei vari frammenti 
gastrinici a lunghezza di catena crescente in soluzioni acquose 
contenenti SDS, in assenza e in presenza di micelle del 
detergente. 
Le proprietà conformazionali dello scheletro peptidico e 
l'intorno delle catene laterali aromatiche sono stati sudiati 
mediante spettroscopia CD e di fluorescenza, sfruttando la 
presenza dei due gruppi cromofori fluorescenti tirosina e 
triptofano. 
Le misure di fluorescenza sono state estese anche ai frammenti 
gastrinici in TFE. 
 
 
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       PARTE SPERIMENTALE 
 
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PARTE SPERIMENTALE: 
      SINTESI 
 
 
MATERIALI 
 
I solventi usati sono prodotti RP della Carlo Erba. Ove 
necessario (THF, DMF) i solventi sono stati distillati secondo 
procedure note. 
H-Trp-OEt, H-Tyr-OH , N-idrossisuccinimmide e isobutil-
cloroformiato sono prodotti Fluka; Fmoc-OSu e’ stato fornito 
dalla CRB,  N-metilmorfolina dalla Merck e anidride acetica dalla 
Carlo Erba. 
I metodi di sviluppo delle lastrine TLC hanno richiesto 
reattivi sensibili agli anelli aromatici: il reattivo di Pauli 
(copulazione fenolica), FeCl3/EtOH (complessi colorati dei 
fenoli), ninidrina/acetone (condensazione cori NH2 libero), sono 
stati preparati al momento dell'uso e conservati solo per tempi 
limitati. 
Gli eluenti impiegati per cromatografia su strato sottile 
sono i seguenti: 
 
-cloroformio /metanolo /ac.acetico 85:10:5 
-butanolo /ac.acetico /acqua 60:20:20 
-cloroformio /ac.acetico /cicloesano 85:10:5 
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Fig. 3   schema di sintesi del dipeptide