Studio sulla proteina MsmDnaB1: una nuova inteina di classe 3

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1. Introduzione 
 1.1 Le Inteine 
Le Inteine sono proteine composte da un numero di amminoacidi molto 
variabile, compreso tra  128 e 800  definite anche introni di proteine (in analogia agli 
introni di RNA) grazie alla loro capacità di mediare un processo di splicing(Y. Anraku 
et al. 2009) (Figura 1.1-1). Ad oggi non è noto il ruolo biologico  di queste proteine; il 
fatto che esse siano state ritrovate in tutti e tre i domini filogenetici (eucarioti, archea, 
procarioti) suggerisce che losplicingproteicoabbia unaantica origineevolutiva (Liu XQ, 
Annu Rev Genet.2000). Le  inteinesono state ritrovate inproteinecon 
funzionidiverse,tra cuienzimi metabolici, DNA e RNA polimerasi, proteasi, 
ribonucleotideriduttasie  ATPasi ditipovacuolare (Bowman EJ et al. J Biol Chem. 
1988). Tuttavia,gli enzimicoinvolti nella replicazionee riparazione del DNAsembrano 
essere piø ricchi di inteine. (Gogarten et al.BMC Evol Biol 2006). La distribuzione 
filogenetica delleinteineè sporadica(Pietrokovski S. Trends in Genetics 2001) (Figura 
1.1-2). La presenza di uninteinain un particolare genenon significa necessariamenteche 
unomologaesteinadauna specie simileo ceppoavrà la stessa inteina. In questo 
momento,non è chiarose il modello didistribuzione delle inteinerappresentila perdita 
diinteineantiche oacquisizionipiørecentidiinteinea causa dellamobilità del gene stesso. 
In molti casianalizzati,il “codonusage”ed il contenutoGCdelleinteineè diverso 
dallaregioneesteina circostante,suggerendo unarecentetrasmissione 
orizzontale.Organismi che hannoun gran numero diinteinepossono averle acquisite 
perchØ(1) possono facilmente prendereil DNAdall'ambiente(naturalmentecompetente), 
(2) per la presenza di virus inazione,elementidi coniugazione, plasmidi ecc. che 
hannoampicampi diaccoglienza,o (3)perchØ ci sonoefficientimacchinari di conversione 
genica e supporto, sistemi di riparazionerotturee /o sistemi diricombinazione(Liu XQ, 
Annu Rev Genet.2000). 
La prima inteina è stata scoperta nell'enzima ATPasi dei vacuoli del lievitoS. 
cerevisiae(Hirata 1990, Kane 1990).  Fu trovato infatti un inserimento in frame nel 
gene VMA1; la sequenza nucleotidica del gene faceva prevedere che la proteina 
corrispondente fosse composta da 1071 amminoacidi per un peso di circa 118 kDa, ma 
di fatto la proteina che si otteneva aveva  una dimensione di 67 kDa.  Le sequenze 
amminoacidiche nelle regioni C- e N- terminale della proteina erano molto simili alle
subunità catalitiche d
mostrava somiglianze
una endonucleasi di 
veniva mantenuto nell’mRN
eliminato in un processo post traduzionale. Per analogia agli introni ed esoni del pre
mRNA, il segmento interno della proteina
(internalproteinsequence
(externalproteinsequence
esclusione  dell’inteina fu chiamato 
importante notare che il processo di 
perchØ si verificasenzacofattoriofonti di energiaesterni
oggi sono incluse nel database InBase curato dalla ricercatrice, la dott.ssa 
FrancinePerler, che per prima ha studiato questo processo.
Figura 
 
subunità catalitiche di ATPasi vacuolari di altri organismi;  la sequenza 
mostrava somiglianze con altre subunità delle ATPasi note, mentre risultava simile ad 
una endonucleasi di S. cerevisiae codificata dal gene HO. L’inserimento 
veniva mantenuto nell’mRNA che veniva tradotto nella proteina 
eliminato in un processo post traduzionale. Per analogia agli introni ed esoni del pre
il segmento interno della proteina, fu denominato inteina 
internalproteinsequence)e i segmenti esterni furono definiti esteine 
externalproteinsequence). Il processo che porta alla ricombinazione delle esteine ed 
esclusione  dell’inteina fu chiamato splicing (Perler FB et al. Nucleic Acids 1994
importante notare che il processo di splicingdelle proteineè un processo
senzacofattoriofonti di energiaesterni. Tutte le inteine scoperte ad 
oggi sono incluse nel database InBase curato dalla ricercatrice, la dott.ssa 
FrancinePerler, che per prima ha studiato questo processo. 
Figura 1.1-1. Processo di splicingpost-traduzionale delle inteine. 
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i ATPasi vacuolari di altri organismi;  la sequenza interna non 
mentre risultava simile ad 
codificata dal gene HO. L’inserimento in frame 
A che veniva tradotto nella proteina VMA1 e poi veniva 
eliminato in un processo post traduzionale. Per analogia agli introni ed esoni del pre-
fu denominato inteina 
furono definiti esteine 
). Il processo che porta alla ricombinazione delle esteine ed 
Nucleic Acids 1994). E’ 
è un processo auto-catalitico 
Tutte le inteine scoperte ad 
oggi sono incluse nel database InBase curato dalla ricercatrice, la dott.ssa
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Figura1.1-2. Distribuzionefilogenetica delleinteinenelle diverse specie. L’albero è unarappresentazione schematica 
dellarelazionetra le specieil cui interogenoma è stato completamenteo quasisequenziato. Innero, leinteine 
nonrilevate; Inrosso, la presenza diinteine; Ingrigio, le inteine assenti nelle specieil cuigenoma ènon del 
tuttosequenziato.  
 
1.2 Struttura delle inteine 
 
Le inteine sono classificate in due grandi gruppi in base alle loro dimensioni: 
inteine grandi e  mini-inteine. Le prime contengono un dominio endonucleasico 
caratterizzato da motivi delle famiglie DOD e HNH di endonucleasi di inserimento 
(homing endonucleases). Queste  inteine sono proteine bifunzionali con un dominio di 
splicing e un dominio centrale endonucleasico. Le mini inteine mancano del dominio 
endonucleasico. E’ stato dimostrato che è possibile ingegnerizzare mini-inteine a 
partire da grandi inteine eliminando il dominio endonucleasico senza perdere in 
efficienza di splicing. Questa scoperta è  una conferma del fatto che il dominio 
endonucleasico non è coinvolto nello splicing. (Chong e Xu 1997, Derbyshire 1997, 
Shingledeckder 1998). Lo studio di un elevato numero di inteine ha permesso di
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identificare blocchi conservati e caratteristiche comuni alla maggior parte delle inteine. 
(Figura 1.2-1). 
Come evidenziato in figura 3, ai fini dello splicing è molto importante  la presenzadei 
quattroresidui conservati nella giunzionedi splicing: 
- Serina, TreoninaoCisteinaall’ N-terminale dell’inteina 
- lldipeptideIstidina-AsparaginaoIstidina-GlutamminaalC-terminale dell’inteina 
- Serina, TreoninaoCisteinasuccessive alsito di splicinga valle (all’N-terminale della 
C-esteina) 
 
 
 
Figura 1.2-1. Motivi conservati nelle inteine (in alto) e mini-inteine (in basso). I residui che partecipano alla 
reazione di splicing dell’inteina sono evidenziati in rosso (appartenenti all’inteina) e in blu (residui sull’esteina). 
 
I motivi conservati sono divisi in blocchi: Blocchi A, B,C, D,E, H, F, G (Pietrokovski 
1994 ePerler1997)oblocchiN1, N3, EN1, EN2, EN3, EN4, C2 e 
C1,rispettivamente(Pietrokovski 1998). I blocchiN2e N4non sono ben conservatinella 
maggior parte delleinteine(Pietrokovski1998). I blocchiA,N2, B, N4, F e G 
sonocoinvolti nellosplicingdelle proteine ed infatti sono comuni alle grandi e alle 
mini-inteine. I blocchiC, D, E e H sonoparte del dominio diendonucleasi di inserimento 
DOD (homing endonuclease domain). Questi blocchi del dominioendonucleasico 
tendono ad essere piøconservatirispetto aimotividi splicinge sono utilizzati per 
l’identificazione di nuove inteinea partire dalla struttura primaria di una proteina. 
Tuttavia, la presenzadi dominiendonucleasicinon è sufficiente perclassificareuna
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proteinacomeinteina, dal momento che molteendonucleasisonofree-standingosi 
trovano inintroni. Mini-inteine che mancano di questi motiviDODsono quindipiø 
difficili daidentificare,soprattuttoquando contengonosequenze non-consenso in 
posizioniconservate(Perler, F. B. 2002). 
 
1.3 Meccanismi di splicing 
Ad oggi sono note tre  classi di inteine. La classe piø studiata e meglio 
caratterizzata delle inteine è la classe 1. Un allineamento di alcune sequenze di 
proteine   appartenenti a questa famiglia è riportato in Figura 1.3-1 per mettere in  
evidenza i residui conservati. 
 
 
Figura 1.3-1. Allineamento inteine di classe 1. In azzurro i residui conservati; In rosso i residui conservati 
importanti per  il meccanismo di splicing. 
 
Per la classe 1 di inteine il meccanismo di splicing ad oggi accettato prevede le 
seguenti reazioni (Figura 1.3-2):  
1) La giunzione di splicing all’ N-terminale dell’inteina viene attivata da un 
riarrangiamento acilico N-O o N-S che muove la N-esteina verso la catena laterale 
della serina / cisteina all’ N-terminale dell’inteina formando l’intermedio lineare estere 
/ tioestere.  
2) Amonte il legameestere/tioestereèattaccato, durante unareazione di trans-
esterificazione,dal gruppo ossidrile/tiolodei residui serina/treonina/cisteina della C-
esteina, con conseguente scissioneall’N-terminaledella giunzionedi splicing e il 
trasferimento dellaN-esteina allacatena lateraledella C-esteina sui residui di 
serina/treonina/cisteina, formando un intermedio ramificato. 
3) L’intermedio ramificatosi risolve con la ciclizzazionedella asparagina al C-terminale 
dell’inteinaper formareun anellosuccinimidico, con conseguente scissione delC-
terminaledella giunzione di splicing.L’ anello succinimidico può essere idrolizzato per 
formare asparagina oisoasparagina.Inalcune inteine è presente un residuo di