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Caratterizzazione della SHMT dal batterio psicrofilo Psychromonas Ingrahamii e confronto con l'enzima omologo da E. coli

Purificazione del DNA plasmidico

Il kit NucleoSpin Plasmid commercializzato dalla Macherey-Nagel, è stato utilizzato per la purificazione del DNA plasmidico da colture di E. coli cresciute overnight su terreno LB contenente antibiotico.

La tecnologia sulla quale si basa il metodo prevede l’utilizzo di una membrana di silice e sali caotropici; il DNA si lega alla membrana di silice in presenza di alte concentrazioni di sale, i contaminanti sono lavati via e il DNA viene eluito in presenza di basse concentrazioni di sale.

Con il seguente metodo, utilizzando gli appositi tamponi forniti dal kit, il pellet batterico viene risospeso (buffer A1) e il DNA plasmidico liberato dalle cellule ospiti di E. coli mediante lisi alcalina (Buffer A2).

Il Buffer A3 neutralizza il lisato risultante e crea le condizioni appropriate per il legame del DNA plasmidico alla membrana di silice. La procedura viene effettuata secondo il seguente protocollo:

- Centrifugare le cellule batteriche (10 ml di coltura) per 30 secondi a 11.000 rpm e recuperare il pellet.

- Risospendere il pellet in 250 µL di Buffer A1 e mescolare invertendo la provetta.

- Aggiungere 250 µL di Buffer A2 (contenente SDS e NaOH per la lisi cellulare) e mescolare delicatamente invertendo la provetta 6-8 volte. Incubare a temperatura ambiente per un massimo di 5 minuti o finché il lisato non appare limpido.

- Aggiungere 300 µL di Buffer A3 e mescolare invertendo la provetta 6-8 volte.

- Centrifugare per 5 minuti a 11.000 rpm e recuperare il supernatante (ripetere il passaggio nel caso il supernatante non sia sufficientemente limpido).

- Inserire l’apposita colonna nel tubo da raccolta e caricare il supernatante sulla colonna. Centrifugare per 1 minuto a 11.000 rpm. Scartare la quota eluita.

- (Opzionale) se il DNA plasmidico è preparato da ceppi ospiti contenenti alti livelli di nucleasi è fortemente raccomandato effettuare un ulteriore passaggio aggiungendo 500 µL di buffer A3 e centrifugare per 1 minuto a 11.000 rpm.

- Aggiungere 600 µL di Buffer A4 e centrifugare per 1 minuto a 11.000 rpm. Scartare la quota eluita.

- Centrifugare per 2 min a 11.000 rpm e scartare l’eluato.

- Posizionare la colonna in un tubo “eppendorf” e aggiungere 50 µL di Buffer AE. Incubare per 1 min a temperatura ambiente. Centrifugare per 1 min a 11.000rpm e recuperare il DNA eluito

Questo brano è tratto dalla tesi:

Caratterizzazione della SHMT dal batterio psicrofilo Psychromonas Ingrahamii e confronto con l'enzima omologo da E. coli

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Informazioni tesi

  Autore: Angela Di Bello
  Tipo: Laurea liv.II (specialistica)
  Anno: 2013-14
  Università: Università degli Studi di Roma La Sapienza
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biologia
  Relatore: Stefano Pascarella
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 77

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Parole chiave

metabolismo
cristallografia
plp
shmt
psicrofilo
apoenzima
affinità cofattore
proprietà cinetiche
tetraidrofolato
struttura tridimensionale

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