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Caratterizzazione scheletrica di un modello animale di mucopolisaccaridosi di tipo VI (MPS VI)

Generazione di enzima arisolfatasi-B con una coda C-terminale di acidi aspartici

Le gravi anomalie a carico del tessuto osseo e cartilagineo di pazienti e modelli animali MPS VI, evidenziate da questo e da altri studi, insieme alla limitata efficacia sul fenotipo scheletrico delle terapie attualmente utilizzate per il trattamento della patologia, rendono necessario lo sviluppo di strategie terapeutiche in grado di migliorare l’efficacia dei protocolli di trattamento sul fenotipo in questione.

Uno di questi è l’aggiunta di sequenze ripetute di acidi aspartici (asp) ad una proteina, in questo caso l’ArsB, per aumentarne l’affinità per il tessuto osseo. Abbiamo quindi aggiunto, tramite PCR, la sequenza codificante (CDS) per una coda di 6 asp al C-terminale della CDS dell’ArsB di ratto (rArsB).

La sequenza così ottenuta (ArsB-6ASP), è stata clonata all’interno di un vettore di espressione sotto il controllo del promotore ubiquitario CMV (promotore + “enhancer” del cytomegalovirus). Al fine di caratterizzare la proteina, così ingegnerizzata, abbiamo trasfettato cellule renali di scimmia (COS-7) con tre differenti plasmidi: uno esprimente la CDS dell’ArsB di ratto (pArsB), uno quella dell’ArsB-6-Asp (pArsB-6-Asp) ed un terzo plasmide di controllo codificante per la proteina fluorescente verde (peGFP).

In tutti i casi, insieme al vettore selezionato, è stato cotrasfettato un plasmide codificante per l’enzima modificante le solfatasi SUMF1. Questo perché le cellule trasfettate, esprimendo livelli di ArsB molto più alti di quelli endogeni, potrebbero non riuscire a modificare tutta la proteina prodotta in forma attiva per mancanza di sufficienti livelli di SUMF1.

In questo modo, quindi, si evita che il sistema di modificazione delle solfatasi vada a saturazione ed è possibile osservare con precisione differenze nei livelli di ArsB prodotti dalle cellule trasfettate con i diversi costrutti. Inoltre, per normalizzare l’efficienza della trasfezione in ciascun campione, tutte le cellule sono state co-trasfettate con un plasmide codificante per la eGFP sotto il controllo del promotore ubiquitario CBA, promotore ibrido tra l’ ”enhancer” del promotore CMV ed il promotore della β-actina di pollo.

Questo brano è tratto dalla tesi:

Caratterizzazione scheletrica di un modello animale di mucopolisaccaridosi di tipo VI (MPS VI)

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Informazioni tesi

  Autore: Anita Capalbo
  Tipo: Tesi di Laurea
  Anno: 2008-09
  Università: Università degli Studi di Napoli - Federico II
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biologia molecolare e cellulare
  Relatore: Luciano Gaudio
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 80

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Parole chiave

infiammazione
attività
western blot
femore
trasfezione
fibroblasti
tessuto osseo
sei acidi aspartici
cmv-rarsb-6asp
arylsolfatsi b
uptake
mucopolisaccaridosi di tipo vi
cristalli di idrossiapatite
secrezione
c-terminale
apparato scheletrico
cd68
cos-7
six aspatic acid

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