Effetto di due diversi trattamenti farmacologici sull'alterazione della vescica in un modello animale di Sindrome Metabolica

Il grado di ossigenazione dei campioni di vescica è stato analizzato mediante uno specifico kit (Hypoxyprobe TM-1, Chemicon International, CA, USA) che utilizza un farmaco bio-reattivo, il pimonidazolo-idroclorito (Hypoxyprobe-1, 60mg/kg), che viene iniettato intraperitonealmente un’ora prima del sacrificio, riconosciuto come marcatore standard della presenza di ipossia. Il pimonidazolo è solubile in acqua e viene rapidamente distribuito a tutti i tessuti del corpo, e costituisce degli addotti proteici esclusivamente nelle zone ipossiche, che hanno quindi una pressione di ossigeno uguale o inferiore a 10 mmHg. Brevemente, i campioni di vescica fissati in formalina 4% subito dopo l’ isolamento, vengono deidratati e incorporati in paraffina. Le cellule ipossiche sono facilmente individuate con un anticorpo monoclonale (Hypoxyprobe-1 Mab1), seguendo il protocollo della casa produttrice (Vignozzi et al., 2006; Morelli et al., 2010).
Al fine di localizzare rispettivamente l’ipossia nei muscoli lisci e nelle cellule uroteliali, alcune sezioni sono state analizzate con altre tecniche di immunoistochimica con anti-desmina (1:100; Santa Cruz Biotechnology, Segrate Milano, Italia) seguita dalla coniugazione con anticorpo secondario di topo, anti-goat FITC, o anti-pan citocheratina (1:50; Novocastra, Wetzlar, Germania) seguita dalla coniugazione di anticorpo secondario Alexa Flour 488 (1:200. Molecular Brobs, Monza, Italia).
La quantificazione dell’ipossia è avvenuta usando Adobe Photoshop 6.00 ® software (Adobe Systems).
Alcune sezioni di vescica sono state usate per analisi immunoistochimiche sull’espressione di CD45. Brevemente le sezioni sono state lasciate in incubazione per una notte a 4° C con l’ anticorpo primario monoclonale murino di topo CD45 (1:100 vol/vol, Dako-120 Cytomation, Germania) come primo anticorpo. Le sezioni sono state lavate in PBS, incubate prima con l’anticorpo secondario bioetinilato e successivamente con il complesso perossidasi streptavidin-biotina (Ultravision large volume detection system anti-polyvalent, Lab-Vision, Fremont, CA, USA).
Il prodotto della reazione è stato ottenuto utilizzando come cromogeno la 3’, 3’-diaminobenzidina tetraidrocloride (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). I vetrini sono stati valutati e fotografati usando un microscopio Nikon Microphot-FXA (Nikon, Tokyo, Giappone), secondo un protocollo sperimentale già pubblicato (Vignozzi et al., 2012).