Produzione e caratterizzazione di un anticorpo policlonale diretto contro anticorpo policlonale umana

Le ribonucleasi sono enzimi ubiquitari che rivestono un ruolo essenziale nel metabolismo dell’ RNA, regolandone la maturazione e la degradazione. La maggior parte delle ribonucleasi sono di natura proteica e vengono classificate in base alla struttura, al pH d’azione oppure al substrato riconosciuto. Negli ultimi anni sono state proposte per questi enzimi funzioni molto diverse: neurotossiche e immunosoppressive, angiogeniche, antiangiogeniche e antitumorali. Il nostro gruppo ha identificato e si sta occupando della caratterizzazione del primo membro umano della famiglia di ribonucleasi Rh/T2/S, enzima di cui è stato dimostrato in vivo un ruolo nel controllo della tumorigenesi e della metastatizzazione. Alla stessa famiglia di ribonucleasi appartengono anche le S-glicoproteine vegetali, proteine secrete coinvolte nell’auto-incompatibilità gametofitica e altre RNasi con un ruolo nella mobilizzazione del fosfato dai tessuti in senescenza o durante lo stress cellulare. RNASET2 è una glicoproteina con un pH ottimale per l’attività catalitica intorno a 5 e il cui sito catalitico è costituito da due brevi sequenze altamente conservate, denominate CAS I e CAS II. Il nostro laboratorio ha dimostrato come essa abbia un pattern di localizzazione complesso all’interno della cellula: la proteina possiede un peptide segnale per la secrezione, che la indirizza al pathway secretorio; dal Golgi però, una parte della proteina viene secreta, mentre una parte segrega e va a localizzarsi a livello dei lisosomi, dove sono presenti esclusivamente le due forme processate per proteolisi al C-terminale. Sono in corso esperimenti volti a testare l’ipotesi che la funzione di oncosoppressore venga svolta dalla frazione di proteina secreta; se questa si dimostrasse vera, è necessario capire se RNASET2 agisce dopo internalizzazione della proteina, da parte della stessa cellula o di cellule vicine
anche di altro tipo, oppure all’esterno della cellula, per esempio in seguito ad interazione con molecole di superficie o con la matrice extracellulare. È stato anche dimostrato che per l’azione oncosoppressiva non è necessaria l’attività catalitica dell’enzima; infatti la sostituzione di due istidine, fondamentali per l’attività catalitica, con altrettante fenilalanine è in grado di sopprimere la tumorigenesi di linee cellulari tumorali, con la stessa efficacia della forma wild-type. Tuttavia, bisogna ancora capire i meccanismi molecolari e cellulari alla base di tale attività oncosoppressiva.
In un precedente lavoro presso questo laboratorio è stata avviata una collaborazione per l’espressione di RNASET2 nel sistema di baculovirus, che permette di produrre buone quantità di proteina ricombinante, caratterizzata dalle stesse modificazioni post-traduzionali della proteina nativa presente in cellule di mammifero; tale proteina ricombinante ha permesso di caratterizzare l’attività catalitica di RNASET2. In questo lavoro di tesi viene descritta la produzione e la conseguente caratterizzazione di un nuovo anticorpo policlonale diretto contro la proteina RNASET2 prodotta nel sistema di baculovirus, per ovviare ai limiti del precedentemente anticorpo diretto contro la proteina ricombinante prodotta in batteri. Questo anticorpo era stato messo a punto nella tecnica di western blotting, e ha permesso la caratterizzazione delle forme di RNASET2 presenti nella cellula e la loro distribuzione spaziale, anche se con qualche limite di sensibilità; tuttavia aveva dato scarsi risultati nelle tecniche di immunoistochimica, immunoprecipitazione e immunofluorescenza, rivelandosi poco efficace e sensibile per lo studio della proteina in forma nativa.
La proteina ricombinante prodotta in baculovirus è stata purificata mediante
cromatografia di affinità, utilizzando l’His-tag aggiunto al C-terminale di RNASET2, e usata per produrre il nuovo anticorpo, denominato anti-RNASE-2, che è stato successivamente messo a punto con successo in diverse tecniche, quali western blotting, immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Inoltre, per la messa a punto di tali tecniche il progetto di tesi ha previsto anche il clonaggio di RNASET2 nel vettore pIRESneo3, per l’espressione della proteina come prodotto di fusione con il “FLAG-tag” in diverse linee cellulari; i cloni trasfettati sono stati utilizzati per esperimenti di immunofluorescenza e immunoprecipitazione, per permettere l’uso di anticorpo commerciale di controllo. Per il futuro ci proponiamo di mettere a punto l’anticorpo anche negli studi di immunoistochimica, per definire il pattern di espressione della proteina in tessuti sani e tumorali di diversa origine.
Lo scopo di queste tecniche è quello di permettere una migliore caratterizzazione delle sue funzioni, sia mediata dall’attività catalitica che da eventuali altri meccanismi quali le interazioni proteina-proteina, e valutare il grado di espressione in condizioni sia fisiologiche che patologiche.