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Metodiche di ingegneria genomica con particolare riguardo al sistema CRISPR-Cas9: possibili applicazioni

Estratto della Tesi di Flavio De Chicchis

Estratto dalla tesi: Metodiche di ingegneria genomica con particolare riguardo al sistema CRISPR-Cas9: possibili applicazioni
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mutazioni al suo interno o di studiare gli effetti sull’organismo
relativi alla sua assenza. Dato che quasi ogni gene umano presenta
un corrispettivo ad alto grado di omologia nel topo (Mus Musculus), i
topi sono considerati principali modelli animali per comprendere le
vie attraverso le quali il nostro materiale genetico codifica le
informazioni. Il gene targeting effettuato da Capecchi sfrutta il
meccanismo di riparazione della ricombinazione per omologia con lo
scopo di sostituire una sequenza di DNA cromosomica con un’altra di
origine esterna, a patto che il DNA esogeno abbia una regione di
omologia a monte e a valle della sequenza che si vuole inserire.
4
  Le
metodiche per la realizzazione di un gene targeting variano a
seconda dell'organismo utilizzato, quella effettuata su Mus musculus
da Capecchi segue i seguenti passaggi:
1. Si prelevano cellule staminali embrionali dalla massa cellulare
delle blastocisti murine.
2. Si costruisce un apposito vettore. Il vettore deve avere la
sequenza genica appartenente al gene che si vuole inattivare ma
interrotta da un marcatore di selezione positiva, come la
resistenza alla neomicina (neo
R
). Inoltre deve essere presente un
marcatore di selezione negativa a valle di tale sequenza
interrotta. Nell’esperimento condotto da Capecchi è stato usato a
tal proposito il  “ gene suicida “ dell’Herpex Simplex Virus che
codifica per la timidina-chinasi (HSV-Tk). I geni suicidi sono in
grado di rendere le cellule sensibili all'azione di farmaci
normalmente ben tollerati. La Tk virale sarà quindi in grado di
convertire il farmaco Gancyclovir in un composto tossico per la
cellula. Se avviene ricombinazione omologa, il gene HSV-Tk verrà
escluso dall’inserzione nel genoma della cellula bersaglio e quindi
in presenza di Gancyclovir non si avrà morte cellulare. Al
contrario, se avviene un’inserzione casuale, allora verrà inserita
anche la sequenza HSV-Tk. Di conseguenza si assisterà a morte
cellulare in presenza di Gancyclovir (Figura 3).
3. Introdurre il vettore nelle cellule staminali murine attraverso la

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Metodiche di ingegneria genomica con particolare riguardo al sistema CRISPR-Cas9: possibili applicazioni

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Informazioni tesi

  Autore: Flavio De Chicchis
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2014-15
  Università: Università degli Studi della Tuscia
  Facoltà: Scienze Biotecnologiche
  Corso: Biotecnologie
  Relatore: Giampiero Gualandi
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 68

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Parole chiave

aids
terapia genica
ricombinazione omologa
crispr-cas9
talen
ingegneria genomica
endonucleasi cas9
immunità batterica
forbici molecolari
zinc finger

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