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Proteomica comparativa applicata allo studio di specifici profili proteici

Estratto della Tesi di Antonio Rosato

Estratto dalla tesi: Proteomica comparativa applicata allo studio di specifici profili proteici
Tesi	
  di	
  Laurea	
  Magistrale	
  in	
  Scienze	
  Chimiche 	
  
Antonio	
  Rosato 	
   	
   3.	
  La	
  Proteomica 	
  
	
  
	
  
8	
  
3.3. Elettroforesi	
  bidimensionale 	
  
L'impiego	
  di	
  tecniche	
  ortogonali	
  per	
  la	
  separazione	
  di	
  miscele	
  proteiche	
  in	
  biochimica 	
  può	
  
essere	
  fatto	
  risalire	
  alla	
  fine	
  degli	
  anni	
  cinquanta,	
  con	
  l'introduzione	
  dell'elettroforesi	
  ad	
  alto	
  
voltaggio	
   combinata	
   con	
   la	
   cromatografia	
   di	
   ripartizione	
   su	
   supporto	
   cartaceo	
   per	
   la	
  
separazione	
  dei	
  peptidi.	
   In	
  quegli	
  anni	
  si	
  diffondeva	
  l'uso	
  dei	
  gel	
  di	
  poliacrilammide	
  come	
  
supporto	
  per	
  la	
  separazione	
  elettroforetica	
  delle	
  proteine .	
  Si	
  diffusero	
  anche 	
  l'elettroforesi	
  in	
  
presenza	
   di	
   un	
   detergente	
   anfifilico,	
   il	
   duodecilsolfato	
   di	
   sodio	
   (SDS),	
   e	
   l'elettroforesi	
   in	
  
gradiente	
  di	
  pH	
  (isoelettrofocalizzazione), 	
  che	
  si	
  imposero 	
  successivamente	
  come	
  tecniche	
  ad	
  
elevata	
  risoluzione.	
  Mediante	
  la	
  prima	
  tecnica	
  era	
  possibile	
  separare	
  le	
  proteine	
  in	
  base	
  al	
  loro	
  
peso	
  molecolare,	
  mentre	
  con	
  l’elettroforesi	
  in	
  gradiente	
  di	
  pH	
  era	
  possibile	
  separarle	
  in	
  base	
  al	
  
loro	
  punto	
  isoelettrico.	
  
L'utilizzazione	
   ortogonale	
   di	
   queste	
   due	
   tecniche	
   separative ,	
  che	
   sfruttano	
  due	
   parametri	
  
caratteristici	
   delle	
   proteine,	
   portò, 	
   verso	
   l a	
   metà	
   degli	
   anni	
   settanta,	
   all'adozione	
  
dell'elettroforesi	
  bidimensionale	
  (2-­‐DE)	
  su	
  gel	
  di	
  poliacrilammide	
  come	
   tecnologia	
  d'elezione	
  
per	
  la	
  separazione	
  di	
  miscele	
  proteiche	
  particolarmente	
  complesse.	
  
L’elettroforesi	
   bidimensionale	
   separa	
   le	
   proteine	
   secondo	
   la	
   loro	
   carica	
  mediante	
   la	
  
focalizzazione	
   isoelettrica	
   in	
   prima	
   dimensione,	
   secondo	
   il	
   loro	
   peso	
   molecolare 	
  mediante	
  
l’SDS-­‐PAGE	
  in	
  seconda	
  dimensione.	
  	
  
Con	
  l’introduzione	
  dei	
  gradienti	
  immobilizzati	
  di	
  pH	
  (IPG-­‐STRIP)	
   sono	
  stati	
  superati	
  i	
  problemi	
  
relativi	
  all’ instabilità	
  dei	
  gradienti	
  di	
  pH	
  nel	
  tempo	
  ed	
  alla	
  riproducibilità	
  del	
  risultato.	
  	
  
Questi	
   nuovi	
   gradienti	
   sono	
   creati	
   da	
   un	
   numero	
   limitato	
   di	
   prodotti	
   chimici	
   ben	
   definiti	
  
chiamati	
  immobiline	
  che	
  vengono	
  copolimerizzate	
  e	
  legate	
  covalentemente	
  alla	
  matrice	
  di	
  
poliacrilammide	
  durante	
  l’assemblaggio	
  delle	
  IPG-­‐STRIP.	
  In	
  questo	
  modo	
  il	
  drift	
  catodico	
  viene	
  
eliminato.	
  
Le	
  IPG-­‐STRIP	
  permettono	
  la	
  generazione	
  di	
  gradienti	
  di	
  qualsiasi	
  range	
  di	
  pH	
  (largo,	
  stretto	
  o	
  
ultra-­‐stretto	
  tra	
  pH	
  3	
  e	
  12)	
  .	
  
Oggi	
  l’elettroforesi	
  bidimensionale	
  è	
  una	
  tecnologia	
  analitica	
   relativamente	
  semplice	
  e	
  poco	
  
costosa	
  che	
  separa	
  le	
  proteine	
  di	
  una	
  miscela	
  complessa.	
  A	
  seconda	
  delle	
  dimensioni	
  e	
  del	
  
gradiente	
  di	
  pH	
  utilizzato, 	
  è	
  possibile 	
  risolvere	
  più	
  di	
  5000	
  proteine	
  simultaneamente	
  (~2,000	
  
proteine	
  di	
  routine),	
  e 	
  si	
  possono 	
  rivelare	
  quantità	
  inferiori	
  a	
   1	
  ng	
  di	
  proteine	
  per	
  spot	
   (gli	
  spot 	
  
sono	
  le	
  macchioline	
  contenenti	
  le	
  proteine	
  che	
  compaiono	
  sui	
  gel	
  una	
  volta	
  che	
  si	
  effettua	
  la	
  
colorazione).	
   L’elettroforesi	
  bidimensionale	
   fornisce	
  inoltre	
  una	
  mappa	
  proteomica	
  che	
  riflette	
  i	
  

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Proteomica comparativa applicata allo studio di specifici profili proteici

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Informazioni tesi

  Autore: Antonio Rosato
  Tipo: Laurea II ciclo (magistrale o specialistica)
  Anno: 2012-13
  Università: Università degli Studi di Bari
  Facoltà: Chimica
  Corso: Scienze chimiche
  Relatore: Gerardo Palazzo
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 117

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