Confronto strutturale e funzionale di anticorpi ingegnerizzati scFvαHER-2

  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Introduzione 
 
 1
1. ANTICORPI 
1.1 Struttura e composizione molecolare 
Si definiscono come anticorpi (Ab) una vasta famiglia di glicoproteine 
plasmatiche (dette immunoglobuline, Ig) sintetizzate dai linfociti B, circolanti nel 
sangue e nella linfa, in risposta a sostanze estranee introdotte nell�organismo, 
dette antigeni (Ag), e caratterizzate dalla propriet� primaria di reagire 
specificamente con questi ultimi legandovisi (Nose & Wigzell, 1983; Pluckthun, 
1991). 
Tutte le immunoglobuline, e pertanto tutti gli anticorpi, sono riconducibili 
ad una subunit� monomerica, la cui struttura fondamentale � sempre la stessa. 
Essa � formata da due coppie simmetriche di catene polipeptidiche che, in base al 
peso molecolare, vengono definite pesanti (o H, da heavy) e leggere (o L, da 
light).  (Edelman, 1970).  
A partire da questa struttura di base, in rapporto a differenze di grandezza, 
contenuto di carboidrati, attivit� biologica e potere antigene, si distinguono cinque 
principali classi (a loro volta poi suddivisibili in sottoclassi) di Ig: IgA, IgD, IgG 
(quelle contenute in maggior quantit� nel siero), IgE e IgM. Le immunoglobuline 
IgG, IgD e IgE sono formate da una sola subunit� monomerica, le IgM sono 
polimeriche, cio� formate da pi� (tipicamente, cinque) subunit� identiche fra loro, 
le IgA possono presentarsi sia in forma monomerica che in forma dimerica. 
Ciascuna classe di Ig � determinata dalla natura delle catene H. 
Le catene H delle immunoglobuline hanno un peso molecolare variabile tra 
i 45 kDa e i 55 kDa con un numero di aminoacidi che va da 450 a 550. Nei 
vertebrati superiori si annoverano almeno cinque isotipi principali di catene H, 
detti α , δ , γ , ε  e µ , cui corrispondono, rispettivamente le gi� citate classi IgA, IgD, 
IgG, IgE e IgM. Le catene H sono caratterizzate generalmente da quattro domini: 
un dominio aminoterminale, diverso da catena a catena, detto dominio (o regione) 
variabile o V
H
, e tre domini in posizione carbossiterminale, uguali in tutte le 
catene appartenenti alla stessa classe o sottoclasse, che rappresentano i domini (o 
regioni) costanti, detti anche, rispettivamente, C
H
1, C
H
2 e C
H
3. Le catene pesanti, 
a differenza di quelle leggere, presentano dei residui carboidratici il cui numero e 
tipo variano a seconda della classe considerata. In genere tali radicali carboidratici 
sono uniti alla catena proteica da un legame N-glicosidico tra l�azoto amidico di 
 2
un residuo di asparagina (appartenente a C
H
2) e uno di N-acetilglucosamina 
(dell�unit� saccaridica).  
Le catene L hanno un peso molecolare di circa 23kDa e sono composte da 
210 � 220 aminoacidi. Nei vertebrati superiori sono state identificate due diverse 
forme (o isotipi) di catene leggere, κ  e λ , che possono associarsi indifferentemente 
con qualsiasi tipo di catena pesante, e la cui proporzione negli anticorpi varia da 
specie a specie: cos�, ad esempio, nell�uomo il 60% delle catene L � di tipo κ  e il 
40% di tipo λ , mentre nel topo il 90% di tutte le catene L � rappresentato 
dall�isotipo κ . Anche le catene L sono caratterizzate da due domini: quello della 
met� carbossiterminale, comprendente circa 110 aminoacidi, � uguale in tutte le 
molecole che appartengono allo stesso isotipo, e per tale motivo � detto dominio 
costante della catena leggera o C
L
. Il dominio della met� aminoterminale, 
comprendente i restanti 110 aminoacidi circa, essendo diverso da anticorpo ad 
anticorpo, � detto dominio variabile o V
L
. 
FIGURA 1.  Struttura schematica di una immunoglobulina IgG. 
V
L
 = dominio variabile della catena leggera;  
C
L
 = dominio costante della catena leggera;  
V
H
 = dominio variabile della catena pesante;  
C
H
1, C
H
2, C
H
3 = domini costanti della catena pesante;  
CDR1, CDR2, CDR3 = regioni determinanti la complementariet� 
 3
Una singola molecola anticorpale, che ha una struttura di base simile ad 
una Y (Huber et al., 1976) (FIGURA 1), consiste sempre di due catene L dello 
stesso isotipo (o entrambe κ  o entrambe λ ) e di due catene H identiche, che, come 
si � gi� detto, definiscono la classe di appartenenza dell�anticorpo. Le forze che 
tengono unite le due catene H tra loro e le catene L alle rispettive catene H sono 
sia di natura covalente (ponti disolfuro) sia di natura non covalente (interazioni 
idrofobiche). Sull�estremit� di ciascun braccio della Y, dove si localizzano i 
domini variabili V delle catene H-L, gli anticorpi presentano due siti identici di 
legame per l�antigene (Milstein, 1985). La regione V � la sola responsabile della 
specificit� per l�antigene: l�attivit� anticorpale delle Ig � quindi limitata ad una 
sola porzione dell�intera molecola dell�immunoglobulina. Tutte le altre funzioni 
biologiche delle Ig (quali l�attivazione del complemento, l�aderenza ai macrofagi 
ecc.) dipendono da strutture localizzate a livello della regione C.  
Mediante l�azione proteolitica dell�enzima papaina � possibile scindere la 
molecola anticorpale in tre frammenti (Porter, 1960): due sono identici e 
conservano la capacit� di legarsi specificamente con l�antigene formando un 
complesso solubile che non precipita; essi vengono chiamati frammenti Fragment 
antigen binding (Fab). Il terzo frammento non � capace di legarsi con l�antigene e 
viene chiamato frammento Fragment crystallizable (Fc) perch� si pu� ottenere in 
forma cristallina. Ogni frammento Fab � costituito da una porzione della catena H, 
includente V
H
 e C
H
1, e da tutta la catena L, includente V
L
 e C
L
. I domini variabili, 
sia V
H
 sia V
L
, non presentano una variabilit� uniforme ma sono costituiti da 
segmenti polipeptidici relativamente invariabili - che funzionano da intelaiatura 
della molecola e sono denominati Framework Region (FR) - tra i quali sono 
intercalati dei segmenti mostranti un�alta variabilit� aminoacidica rispetto al resto 
della catena, noti come regioni ipervariabili o Complementarity-Determining 
Regions (CDR1, CDR2, CDR3). E� proprio la variabilit� di tali segmenti che 
permette al sito combinante di assumere le forme pi� diverse e quindi di essere 
�complementare� ai pi� svariati determinanti antigenici. 
Il frammento Fc � composto esclusivamente dai domini costanti C
H
2 e C
H
3 
delle catene H. 
L�elevato numero di legami disolfuro - sia tra le due catene H, sia tra 
catene L e corrispondenti catene H, sia tra residui di cisteina situati sulla stessa 
 4
catena polipeptidica - nonch� la ricchezza di interazioni non covalenti 
conferiscono alla molecola una particolare rigidit� e compattezza. Vi � un solo 
punto della molecola che � abbastanza flessibile ed � situato nel tratto della catena 
pesante al confine tra Fab e Fc, dove sono situati i legami H-H e H-L. Tale 
regione, che prende il nome di regione cerniera (o hinge region), permette ai due 
frammenti Fab di ruotare attorno al frammento Fc e legarsi cos� a determinanti 
antigenici pi� o meno distanti fra loro.     
 
1.2 Struttura dei domini immunoglobulinici  
Come si � visto nel paragrafo precedente, ciascuna delle catene componenti 
l�immunoglobulina � costituita da un dominio costante C (C
H
 e C
L
) e da un 
dominio variabile V (V
H
 e V
L
).  
Il dominio costante C ha come motivo strutturale una �chiave greca�, ed � 
composto da sette filamenti β  antiparalleli costituenti due distinti foglietti β , uno a 
tre e l�altro a quattro filamenti (FIGURA 2). Com�� tipico per la struttura β a 
foglietto (o β  sheet
1
), le catene adiacenti di aminoacidi in conformazione estesa 
(filamenti β  o β  strands) sono tenute insieme da legami idrogeno laterali. (Capra 
& Edmundson, 1977; Alzari et al., 1988). I filamenti adiacenti sono collegati tra 
loro da quei particolari  loop 
2
 presenti nel punto in cui le catene polipeptidiche 
dei filamenti di un foglietto β  antiparallelo cambiano la propria direzione di 180�, 
detti ripiegamenti β  o a forcina (o β  hairpins) (Sibanda & Thornton, 1985). I due 
foglietti β , grazie ad un ponte disolfuro conservato che li tiene legati 
covalentemente, sono giustapposti a formare il peculiare ripiegamento delle 
immunoglobuline noto come sandwich β . I domini costanti si associano attraverso 
interazioni a carattere idrofobico tra i rispettivi foglietti a quattro filamenti, le cui 
direzioni relative sono quasi ad angolo retto. 
Il dominio variabile V ha una struttura che non si discosta in modo 
sostanziale da quella del dominio costante eccetto per il fatto che presenta due 
filamenti β  in pi�  (FIGURA 2). Anche in questo caso il dominio � costituito da 
due foglietti β , uno a quattro e l�altro a cinque filamenti, giustapposti tra loro 
                                                           
1
 Il β  sheet � uno dei due tipi principali di struttura secondaria nelle proteine; l�altro � la α -elica. 
 
2
 Il termine loop si riferisce a sezioni della catena polipeptidica che collegano regioni di struttura 
secondaria. 
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grazie alla presenza di un ponte disolfuro. I due filamenti β  in pi� presenti nel 
dominio V sono collegati tra loro da una struttura a forcina contenente la regione 
ipervariabile CDR2 che si posiziona, nello spazio, in prossimit� delle altre due 
regioni ipervariabili CDR1 e CDR3, a loro volta presenti sui loop che collegano i 
filamenti β  2-3 e 6-7, rispettivamente. I due domini variabili, V
L
 e V
H
, sono 
associati tra loro attraverso interazioni tra i rispettivi foglietti a cinque filamenti. 
FIGURA 2. Schematizzazione delle strutture a sandwich β  dei domini 
variabile e costante delle Ig. 
Le frecce indicano i filamenti β  connessi tra loro dai loop.  
In basso � rappresentato il motivo a chiave greca. 
 
Il sito di legame per l�antigene � costituito da sei loop corrispondenti alle 
sei regioni ipervariabili. I tre loop corrispondenti alle tre regioni ipervariabili 
CDR1, CDR2 e CDR3 del dominio V
L
 sono denominati, rispettivamente, L1, L2 e 
L3. I tre loop corrispondenti alle omologhe regioni ipervariabili del dominio V
H
 
sono denominati H1, H2 e H3. I loop L1 e H1 connettono filamenti di foglietti 
differenti all�interno dei domini V
L
 e V
H
. L2, L3, H2 e H3 sono hairpin. Dalle 
strutture dei sei loop - che dipendono dalla lunghezza e sequenza aminoacidica 
 6
delle regioni di cui fanno parte - dipende la specificit� e affinit� delle 
immunoglobuline e, in particolare, dei loro siti di legame dell�antigene. 
Alcuni hairpin sono corti (3-4 residui) e la loro conformazione dipende 
principalmente dalla posizione all�interno del loop di alcuni residui aminoacidici 
(solitamente glicina, asparagina, acido aspartico o prolina) (Sibanda et al.,1985; 
Leszczynski & Rose, 1986). Per i loop di medie dimensioni (6-10 residui) la 
conformazione - contrariamente al caso degli  hairpin - non dipende dalla 
sequenza aminoacidica, ma dipende da interazioni terziarie riguardanti una 
piccola frazione di residui; ad esempio attraverso legami idrogeno e meccanismi 
di packing coinvolgenti aminoacidi vicini appartenenti sia alla CDR-H2 sia ad una 
delle regioni framework (Tramontano et al.,1990).  
L�analisi comparativa delle strutture immunoglobuliniche ha rivelato che 
sequenze diverse in loop di anticorpi diversi non sempre generano conformazioni 
diverse sia nelle catene principali sia nelle catene laterali di queste regioni. E� 
stato dimostrato (Chothia & Lesk, 1987) che cinque dei sei loop (H1, H2, L1, L2, 
L3) possono assumere soltanto un numero limitato di conformazioni delle catene 
principali: le cosiddette �strutture canoniche�. In tali loop, infatti, la maggior parte 
delle variazioni di sequenza nella regione ipervariabile influenzano solo le catene 
laterali dei loop stessi, modificando la superficie del sito di legame per l�antigene, 
senza variare la struttura di base (backbone) del loop. Solo un numero limitato di 
variazioni di sequenza in un numero limitato di posizioni produce la 
trasformazione della catena principale in una diversa conformazione canonica. 
Come si � accennato pi� sopra, anche i residui presenti nelle regioni framework 
possono influenzare la struttura del sito di legame delle immunoglobuline. 
Regioni ipervariabili che hanno le stesse conformazioni in immunoglobuline 
differenti presentano residui uguali o molto simili in questi siti. 
I domini V
H
 e V
L
 delle Ig sono tenuti insieme da legami disolfuro e forze 
di Van der Waals. La rigidit� della geometria che ne consegue comporta che le 
regioni framework dei domini V
H
 e V
L
 formino insieme un�impalcatura (scaffold) 
dalla struttura relativamente costante, sulla quale viene �costruito� il sito di 
legame per l�antigene. I ponti disolfuro sono fondamentali per l�architettura del 
dominio dell�anticorpo e per connettere i foglietti β  tra loro, impedendo cos� 
l�accesso delle molecole di solvente nella struttura nativa del dominio 
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immunoglobulinico. Esperimenti in vivo e in vitro hanno dimostrato la necessit� 
di entrambi i ponti disolfuro sia nella V
H
 sia nella V
L
 per il corretto ripiegamento 
e la stabilit� della struttura. Tuttavia, � stato trovato un anticorpo che, pur 
mancante del ponte disolfuro nella V
H
, si legava egualmente all�antigene 
(Rudikoff & Pumphrey, 1986; Victor-Kobrin et al., 1990). 
Kabat e collaboratori (Kabat et al.,1977; e 1978), analizzando i modelli di 
variabilit� nelle sequenze di immunoglobuline, hanno potuto classificare le 
regioni coinvolte nel legame con l�antigene. 
 
1.3 Anticorpi monoclonali 
Come si � gi� accennato, gli anticorpi costituiscono una naturale difesa 
dell�organismo contro agenti infettanti, virus e batteri causanti malattie. Gli 
anticorpi presentano due caratteristiche peculiari: 
• sono estremamente specifici, legandosi e neutralizzando un particolare 
antigene; 
• continuano a conferire resistenza (in alcuni casi anche per tutta la vita) 
contro una determinata malattia, una volta attivati a seguito della 
comparsa della malattia stessa (�immunit� attiva acquisita 
naturalmente�) o della pratica della vaccinazione (�immunit� attiva 
acquisita artificialmente�). 
Questi meccanismi di resistenza sono noti da molto tempo. Ad esempio, 
Tucidide (429 a.C.), descrivendo la peste di Atene, osservava che i risanati 
raramente si ammalavano una seconda volta, e mai mortalmente. Inoltre, gi� 
intorno al 1000, in Cina e in India, era diffusa la pratica di utilizzare materiale 
patologico di ammalati di vaiolo meno gravi per trattare le persone sane 
(�variolazione�), inducendo in queste una protezione durante le epidemie della 
malattia. Le scoperte riguardanti la produzione e la somministrazione di vaccini 
succedutesi a partire dalla fine del �700 (Jenner) hanno fornito uno dei pi� 
formidabili mezzi per la prevenzione e la lotta contro le malattie infettive.   
Nella met� degli anni settanta, la tecnologia degli �ibridomi� ha reso 
possibile la produzione in vitro di anticorpi diretti contro qualunque molecola 
dotata di effetto immunogenico (Kohler & Milstein, 1975).