Sintesi e caratterizzazione di nuovi inibitori della trombina

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Nel laboratorio presso il quale � stato svolto questo lavoro di tesi sono stati sviluppati 
inibitori multisito diretti, denominati Hirunorm, che sono tra i pi� potenti e selettivi 
inibitori sintetici della trombina attualmente conosciuti (K
i
 ~ 10
-10
 M) [4]. Le molecole 
Hirunorm, costituite da 26 residui amminoacidici, sono capaci di riprodurre il peculiare 
meccanismo di azione dell�irudina [5,6]. Infatti, esse interagiscono con la trombina sia 
al sito catalitico che al FRE; un opportuno spaziatore, che collega le estremit� N- e C-
terminali e costituito da 12 residui amminoacidici, permette che il tetrapeptide N-
terminale sia allineato in maniera parallela al backbone dell�enzima.  
In questo lavoro � stato intrapreso lo sviluppo di nuove molecole, contenenti un anello 
porfirinico quale linker tra i segmenti peptidici N- e C-terminale presenti in Hirunorm. 
L�idea di utilizzare un tale linker � derivata dall�osservazione che sulla superficie della 
trombina, tra i due siti di riconoscimento, vi � una sacca idrofobica sufficientemente 
ampia per ospitare un anello porfirinico. Queste nuove molecole potrebbero trovare 
vantaggiose applicazioni per la diagnosi in vivo e/o in vitro. 
Per l�attuazione di questo progetto, nel presente lavoro di tesi sono state condotte due 
fasi. Una prima fase ha riguardato la sintesi del tripeptide N-terminale e dell�eptapeptide 
C-terminale (corrispondente al segmento 53-59 dell�irudina). La seconda fase ha 
riguardato la messa a punto di un�opportuna strategia di sintesi per ottenere, in buone 
rese, la porfirina desiderata. � attualmente in corso l�assemblaggio dei due segmenti 
peptidici sull�anello porfirinico, al fine di poter successivamente effettuare saggi 
biologici e valutare le propriet� inibitrici delle molecole sintetizzate, nonch� le propriet� 
di binding del nucleo porfirinico nei confronti di vari ioni metallici sia diamagnetici che 
paramagnetici. Sar� cos� possibile valutare la possibilit� di adoperare queste nuove 
molecole nella costruzione di biosensori elettrochimici o paramagnetici per la 
rivelazione di trombi.  
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1. INTRODUZIONE 
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1.1 La trombina: struttura e funzione 
La trombosi � la formazione impropria di un coagulo di sangue (trombo) in un vaso 
arterioso o venoso, dovuta ad un�attivazione incontrollata del sistema emostatico. Essa 
pu� ridurre o arrestare il flusso del sangue (ischemia) e/o dare luogo al distacco di 
frammenti trombotici (emboli), a loro volta in grado di occludere vasi situati pi� a valle. 
La formazione di trombi � il meccanismo patogenetico comune alla base di numerose 
malattie cardiovascolari, quali la cardiopatia ischemica e l'infarto del miocardio, 
l'ischemia cerebrale transitoria e l'ictus cerebrale, le arteriopatie, la trombosi venosa 
profonda degli arti inferiori e l'embolia polmonare. L�insieme delle malattie connesse 
alla trombosi costituisce la prima causa di morte nei paesi occidentali. La trombosi pu� 
essere prevenuta tenendo sotto controllo i diversi fattori di rischio conosciuti ed alcune 
malattie predisponenti. Pu� inoltre essere prevenuta e trattata con farmaci che agiscano 
sul sistema emostatico, cio� sui meccanismi di formazione, crescita e dissoluzione del 
trombo.  
La trombina � una glicoproteina appartenente alla classe delle serino proteasi, ed ha 
ricevuto molta attenzione dal mondo scientifico per il ruolo centrale che svolge 
nell�omeostasi cellulare e nei processi di coagulazione del sangue. L�α -trombina viene 
prodotta nelle ultime fasi del processo a catena di coagulazione del sangue. Essa induce 
la formazione di un coagulo sia mediante la conversione del fibrinogeno in fibrina, sia 
mediante l�attivazione delle piastrine. La trombina � inoltre in grado di attivare altri 
fattori di coagulazione del sangue come i fattori V, VIII, XIII; la proteina S e la proteina 
C [7], di stimolare la secrezione di piastrine e la loro aggregazione, di indurre la 
mitogenesi nei fibroblasti [8] e nei macrofagi [9] e infine presenta propriet� 
chemotattiche.[10] 
L�α -trombina ha una massa di 32.7 Kdal ed � costituita da due catene di 36 residui 
(catena A) e di 259 residui (catena B). Le due catene sono tenute insieme da un ponte 
disolfuro tra il residuo Cys
1
 della prima e il residuo Cys
122
 della seconda catena. 
L�enzima presenta anche altri tre ponti disolfuro localizzati nella catena B (Cys
42
-Cys
58
, 
Cys
168
-Cys
182
, Cys
191
-Cys
220
), che mostra il tipico fold osservato nelle serino-proteasi 
[11]. La catena B consiste di cinque segmenti elicoidali, due domini simili, ciascuno 
contenente una struttura β -barrel a sei strand, e diversi turn.  
 6 
La catena A, caratterizzata da numerosi turn e un breve segmento elicoidale nella zona 
C-terminale, si trova in una fenditura della catena B. La risoluzione strutturale dell�α - 
trombina umana, mediante diffrazione dei raggi X � caratterizzata dalla presenza sulla 
superficie di diverse �fenditure� e �asperit�� probabilmente responsabili della grossa 
variet� di funzioni biologiche sviluppate dall�enzima. Queste �fenditure� o �asperit�� 
infatti sembrano comportarsi come �chiavi� o �serrature� nell�interazione della 
trombina con substrati e/o inbitori. 
In Fig. 1.1 � rappresentata la superficie dell�α -trombina umana dove sono indicati i 
principali siti di interazione. Il sito catalitico, contenente la triade catalitica (Ser 
195
, 
His 
57 
 e Asp 
102
), � situato all�interfaccia tra i due domini β-barrel. Esso � identico, nei 
limiti dell�errore sperimentale, in tutte le strutture cristalline note fino ad oggi, ed 
inoltre mostra la geometria comune a tutte le serino proteasi. Il sito attivo � delimitato 
da un�estesa regione idrofobica, contenente il subsito S
2
 e il cosiddetto �aryl bindig 
site� e dal subsito di specificit� S
1
 [12] L� �ingresso� al sito di specificit� � 
caratterizzato dalla presenza di vari residui carichi negativamente. Tra questi � 
importante ricordare Glu
122
 e Asp
189
 che non sono direttamente coinvolti nella 
formazione di ponti salini intramolecolari ma che rivestono un ruolo importante nel 
riconoscimento di substrati e inibitori. Lontano dal sito catalitico sono situate due 
regioni ad alta densit� di carica positiva. Una di essa, conosciuta come �exosito di 
riconoscimento del fibrinogeno�, si trova approssimativamente intorno al segmento 
65-76. L�exosito di riconoscimento del fibrinogeno � coinvolto nel riconoscimento del 
fibrinogeno, della trombomodulina e dell�inibitore naturale irudina. Tutte queste 
molecole presentano una sequenza peptidica ricca di residui carichi negativamente. 
Un�altra regione a forte densit� di carica positiva � probabilmente coinvolta nel 
legame con l�eparina.