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Modelli di colture cellulari come mezzo per migliorare l'affidabilità di test biologici

Informazioni tesi

  Autore: Sara Maffia
  Tipo: Laurea I ciclo (triennale)
  Anno: 2013-14
  Università: Università degli Studi di Pavia
  Facoltà: Scienze Biotecnologiche
  Corso: Biotecnologie farmaceutiche
  Relatore: Monica Savio
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 29

Le colture cellulari permettono di far crescere le cellule in un ambiente artificiale. Sono uno dei principali strumenti usati nella biologia cellulare e molecolare per studi di fisiologia e biochimica, per indagare gli effetti di diversi composti, la mutagenesi e per produrre composti biologici.
Nel 1907, R. Harrison introdusse la coltura di tessuti, coltivando frammenti di tubo neurale di rana in una goccia di linfa dell'animale, che fu sostituita da M. Burrows nel 1910 con plasma di gallina, per tessuti di animali a sangue caldo. Nel 1953 George e Martha Gey ottennero la prima coltura di cellule immortalizzate, da una biopsia del cancro alla cervice uterina di Henrietta Lacks, da cui derivano le cellule HeLa, ancora oggi utilizzate nei laboratori di tutto il mondo.
Le colture cellulari necessitano di una strumentazione di base (incubatori, cappe a flusso, centrifughe e bagnetti) e strumenti specifici per il tipo di cellule coltivate.
I diversi tipi di cellule richiedono differenti terreni di coltura, ma tutti contengono i nutrienti essenziali, fattori di crescita, ormoni e gas per controllare pH e pressione osmotica, per regolare la crescita delle cellule ed osservare i cambiamenti al variare dei parametri. Il siero è una fonte di fattori di crescita e di adesione, ormoni, lipidi e minerali, ma crea problemi di standardizzazione ed effetti indesiderati. Esistono tre classi di terreni di coltura: i basal media, i reduced-serum media e i serum-free media. Il terreno contiene anche indicatori di pH e tamponi. La temperatura di coltivazione dipende soprattutto dalla temperatura corporea dell'organismo di origine. La cellule possono essere coltivate in adesione o in sospensione.
Una comune modalità di conservazione è la criopreservazione in azoto liquido, almeno a -70°C. Lo scongelamento deve essere rapido, poiché sottopone la cellula a forte stress.
La sterilità è un requisito fondamentale. La contaminazione delle colture rimane infatti il problema più comune e può essere di origine chimica, biologica o da altre linee cellulari.
Per contare le cellule manualmente ci si serve della camera di Bürker, ma esistono strumenti automatici come il contaglobuli.
Le colture cellulari tradizionali sono utili per studiare meccanismi interni alle cellule e la risposta a variazioni dell'ambiente esterno, ma non considerano le interazioni con la matrice extracellulare (ECM) e le cellule circostanti, fondamentali per la risposta in vivo. Nelle colture tridimensionali, invece, le cellule interagiscono con l'ambiente. Queste sono più attendibili per test tossicologici e farmacologici, nello studio dell'adesione e migrazione cellulare, nello studio dei tumori e dell'espressione genica.
La maggior parte dei modelli di colture tridimensionali si serve di "scaffold", cioè supporti per la crescita nelle tre dimensioni, costituiti da polimeri di cui è possibile controllare le proprietà chimiche e strutturali. Possono essere sintetici o derivati naturali.
Esistono diversi modelli di colture tridimensionali, che richiedono tecniche di visualizzazione d'immagine ad alta risoluzione, come le tecniche tomografiche (OCT e OPT), il microscopio confocale a fluorescenza e il microscopio a due fotoni o multifotone.
Un dispositivo di recente sviluppo, ma che si basa su colture tradizionali è l'iCELLigence, un biosensore microelettronico in grado di fornire analisi in tempo reale sulla crescita e adesione cellulare. Il sistema è composto da un analizzatore elettronico che si posiziona nell'incubatore, un iPad con il software associato e piastre a pozzetti in cui vengono depositate le cellule. Questa tecnologia si basa sul fenomeno dell'impedenza, che varia in funzione del numero di cellule ed è espressa come Cell Index (CI).
Nell'esperienza di laboratorio, servendosi dell'iCELLigence sono state indagate le proprietà antiproliferative del Resveratrolo (RSV) e di un suo derivato sintetico, il 4,4’-diidrossi-trans-stilbene (DHS) su cellule di carcinoma polmonare di Lewis. Le cellule sono state trattate con differenti concentrazioni delle due sostanze. Con l'utilizzo dell'iCELLigence sono stati ottenuti dei grafici che mostrano il CI in funzione del tempo. E' emerso che le sostanze agiscono rapidamente, informazione che non è possibile ottenere nelle colture tradizionali a meno di allestire cinetiche temporali molto serrate. Inoltre, il DHS è più efficace nell’inibire la proliferazione cellulare rispetto al RSV, come già dimostrato in altri modelli sperimentali.

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  Autore: Sara Maffia
  Tipo: Laurea I ciclo (triennale)
  Anno: 2013-14
  Università: Università degli Studi di Pavia
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  Lingua: Italiano
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6 3. COLTURE TRADIZIONALI 3.1 Strumentazione di laboratorio Tutti i laboratori in cui si praticano colture cellulari, necessitano di una strumentazione di base che comprende: una cappa per la sterilità, un incubatore che mantiene temperatura e umidità controllate, un bagnetto termostatato, una centrifuga, un frigorifero a 4°C, un refrigeratore per conservare i reagenti da -5°C a -20°C, un contaglobuli, un microscopio diretto e uno invertito, un refrigeratore a -80°C e uno sterilizzatore (es. un'autoclave). Gli altri strumenti dipendono dal tipo di cellule coltivate nel laboratorio [1]. 3.2 Subcoltura e mantenimento Le cellule eucariotiche normali si dividono per un numero finito di volte, prima di andare incontro a senescenza. Attraverso la trasformazione, che può essere spontanea, indotta chimicamente o tramite virus, le cellule possono divenire immortali e costituire così una linea cellulare continua. In questo caso, le cellule possono diventare troppo numerose per poter essere conservate in una fiasca o in una piastra di Petri, e non è sufficiente cambiare il terreno, ma è necessario dividere il quantitativo di cellule in più dispositivi, così che possano proliferare liberamente. Sia le cellule che crescono in adesione che quelle che crescono in sospensione dovrebbero essere subcoltivate prima di raggiungere la confluenza, cioè quando la crescita è nella fase esponenziale (fase log), poiché una volta occupato tutto lo spazio a disposizione, la crescita è bloccata dall'inibizione da contatto e, dopo la nuova semina, impiegano più tempo a tornare alle condizioni normali. Si ha necessità di dividere la coltura anche quando diminuisce il pH del terreno. Questo infatti indica che si sono accumulati i prodotti di scarto del metabolismo cellulare, come l'acido lattico, che può essere tossico per le cellule. In particolare una diminuzione del pH maggiore di 0.2 unità indica la necessità di dividere la coltura [1].

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biologia
in vitro
cellule
colture cellulari
laboratorio
biologia cellulare
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colture tridimensionali
test in vitro

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