Studio del possibile ruolo svolto dal microRNA-140 umano nello sviluppo delle palatoschisi

Le strutture craniofacciali dei vertebrati sono caratterizzate da complesse interazioni tra diversi tipi di cellule precursori che, durante lo sviluppo embrionale, migrano secondo precise modalità, regolate nel tempo e nello spazio. Il maggiore contributo è fornito dalle cellule della cresta neurale embrionale che migrano verso l’estremità cefalica dove danno origine alle strutture nasali, della mascella, della mandibola e del palato. La formazione delle strutture craniofacciali è un processo nel quale intervengono ed interagiscono sia fattori ambientali che genetici.
É recentemente emerso il coinvolgimento dei miRNA, piccoli RNA non codificanti di circa 22 nucleotidi che si legano al 3’ UTR di mRNA bersaglio, in numerosi processi di sviluppo. É stata inoltre riscontrata l’espressione di specifici microRNA nelle cellule precursori di alcune strutture craniofacciali. In particolare, è stato dimostrato, in un modello animale, il coinvolgimento di un miRNA (miR-140) nello sviluppo di alcune strutture craniofacciali mediante la fine regolazione dell’espressione del gene Pdgfra. Alterazioni di questo legame, causate da variazioni dell’espressione del miRNA o del target, sarebbero alla base del fenotipo di labiopalatoschisi osservato nel modello di D. rerio.
In una prima fase del nostro progetto è stato realizzato un approccio integrato, utilizzando dati disponibili in letteratura ed analisi di tipo bioinformatico, che ha consentito di ipotizzare un coinvolgimento del miR-140 nella regolazione di Pdgfra nello sviluppo dei processi labiopalatini nell’uomo. É stata reclutata una casistica di 88 pazienti affetti da palatoschisi ed una casistica costituita da 130 individui di controllo. É stato amplificato il frammento contenente la sequenza codificante il miR-140 e analizzato mediante sequenziamento diretto e restrizione enzimatica al fine di identificare eventuali variazioni di sequenza. I risultati hanno mostrato la presenza di un polimorfismo, annotato nella banca dati dbSNP ma per il quale non erano disponibili informazioni di frequenza nella popolazione, che è risultato polimorfico in entrambe le casistiche. Il sito polimorfico è localizzato alcune basi a valle di un punto di giunzione cruciale per la corretta biogenesi del miRNA, pertanto la presenza di varianti di sequenza potrebbe avere un ruolo funzionale, ad esempio, alterando la struttura secondaria e, di conseguenza, la stabilità o il legame al macchinario di biogenesi. Sono stati realizzati successivamente dei saggi di luciferasi che hanno consentito di validare sperimentalmente il legame del miR-140 con due ipotetici target predetti mediante approcci in silico. Entrambi i target sono coinvolti in meccanismi correlati a processi morfogenetici, anche di strutture craniofacciali.
La presenza di varianti di sequenza nelle sequenze codificanti miRNA e l’identificazione di target può far luce sui meccanismi fisiologici che caratterizzano alcuni processi di sviluppo ma può concorrere anche a chiarire il coinvolgimento di questa classe di piccoli RNA in patologie multifattoriali, ad esempio nei meccanismi patogenetici che sottostanno allo sviluppo delle labiopalatoschisi.