La cute come setaccio molecolare: trasporto selettivo di eparina mediante un nuovo metodo di elettroporazione

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  1.1     STRUTTURA CHIMICA E BIOSINTESI      
DELL’EPARINA 
 
L'eparina è un glicosaminoglicano (GAG) altamente solfatato 
dotato di diverse attività biologiche. La struttura dell’eparina consiste di 
un’alternanza di unità disaccaridiche, composte da residui di acidi 
exuronici (acido D-glucuronico o L-iduronico) e di D-glucosamina, 
legate tra loro da legami glicosidici 1→4. I polimeri sono altamente 
solfatati; l’acido uronico ha il gruppo solfato sull’atomo di carbonio in 
posizione 2 (C-2), mentre la D-glucosamina è N-acetilata o N-solfatata, 
e può essere ulteriormente solfatata in C-6 o C-2.  
 
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Figura 1.   Struttura molecolare dell’eparina 
 
 
 
La diversa disposizione dei gruppi solfato può portare teoricamente 
a 32 diverse unità disaccaridiche che possono essere disposte in diverso 
ordine, dando così luogo ad una notevole eterogeneità strutturale.       
Inoltre, grazie a metodiche di spettroscopia NMR e di diffrazione a raggi 
X è stato possibile ricavare delle indicazioni circa la forma degli 
eparinoidi. L’eparina forma un’elica con periodicità variabile, compresa 
tra 0.82 e 0.87 nm; l’elica sarebbe stabilizzata da legami ad idrogeno tra 
l’atomo di ossigeno posto nell’anello dell’acido uronico ed il gruppo 
idrossilico sul C-3 della glucosamina adiacente. L’eterogeneità 
strutturale è determinata dal meccanismo regolatore della biosintesi. La 
maggior parte degli studi sulla sintesi di eparina sono stati condotti 
incubando preparazioni microsomiali provenienti da cellule mastocitarie 
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con precursori dell’eparina marcati radioattivamente: il donatore di 
solfato, 3’-fosfoadenosin-5’fosfosolfato (PAPS) e i donatori di zuccheri, 
UDPGLcA e UDPGLcNAc. Questi estratti cellulari catalizzano la sintesi 
di una molecola eparinica quando tutti i precursori sono presenti (1). 
 L’eparina nasce come un proteoglicano, composto da un nucleo 
proteico ricco di sequenze in cui si alternano residui di serina e di 
glicina, e da lunghe catene glucosaminoglicaniche legate 
covalentemente al core. I proteoglicani dell’eparina (peso molecolare da 
750.000 a 1.000.000 Dalton) sono stati isolati dalla pelle di ratto, dai 
mastociti peritoneali di ratto e da mastocitoma di topo. In genere il 
contenuto in eparina dei vari organi correla con il numero di mastcellule 
in essi presente. 
 Nelle mastcellule la biosintesi dell’eparina avviene per aggiunte 
successive di unità monosaccaridiche dai corrispondenti UDP-zuccheri 
ai terminali non riducenti delle catene in via di formazione, legate al 
nucleo proteico. Lo scheletro di base viene sintetizzato a partire da un 
trisaccaride costituito da Xilosio-Galattosio-Galattosio. Questo 
trisaccaride è legato ad un gruppo idrossilico del residuo serinico del 
nucleo proteico, il quale, a biosintesi conclusa, costituirà il proteoglicano 
dell’eparina. L’iniziale prodotto di polimerizzazione contiene una 
sequenza alternata di unità di acido glucuronico e di N-acetil 
glucosamina. Successivamente questa struttura non solfatata viene 
coinvolta in una serie di reazioni di modificazioni del polimero che si 
succedono in una rapida ed ordinata sequenza, conducendo alla 
formazione di un numero distinto di specie intermedie. Queste reazioni, 
rappresentate schematicamente in fig. 2, includono in sequenza: la 
deacetilazione dei residui di N-acetilglucosamina, la solfatazione dei 
risultanti aminogruppi liberi, la conversione delle unità di acido D-
glucuronico in unità di acido L-iduronico per azione dellaC-5- 
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epimerasi, una O- solfatazione sull’atomo in posizione 2 dei residui di 
acido iduronico, e, finalmente la O-solfatazione in posizione 3 e 6 delle 
unità di glucosamina. (2) 
 
 
Figura 2.    Biosintesi eparina 
Ciascuna reazione coinvolge solo una frazione delle totali unità 
disaccaridiche, di modo che la modificazione del polimero risulta 
incompleta ed eterogenea. Inoltre, nelle mastcellule, le catene di eparina 
nascenti sono spezzate da una endo-β-glucuronidasi in frammenti più 
piccoli che vengono immagazzinati insieme con proteasi neutre ed 
amine vasoattive nei granuli secretori delle mastcellule. Anche la 
lunghezza delle catene polisaccaridiche liberate dall’azione della endo-
β-glucuronidasi mastocitaria risulta eterogenea. Quindi l’eparina 
estrattiva, usata come farmaco in clinica, è una miscela di catene diverse, 
eterogenee sia per peso molecolare, sia per grado di solfatazione. Il peso 
molecolare può variare da 6.000 a 30.000 dalton; tuttavia il peso 
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molecolare medio delle miscele di eparina convenzionali è intorno a 
15.000 Dalton. 
L’eparina espleta le sue funzioni interagendo elettrostaticamente 
con svariate proteine, il cui comportamento cambia proprio in 
conseguenza di tali associazioni.  
L'eparina endogena (3) è presente non solo, come è ben noto, nei 
granuli secretori dei mastociti, da cui viene rilasciata da stimoli di natura 
infiammatoria, ma anche nel plasma umano, dove circola in stretta 
associazione con peptidi basici, con i quali forma complessi proteolisi 
resistenti (4,5). Tali complessi possono risultare acidi, basici, o neutri a 
seconda del rapporto eparina peptidi. L'eparina e le proteine sono lunghe 
molecole, ma la loro interazione è rivolta a domini ristretti, la cui 
struttura è stata definita in pochi casi. Dai dati disponibili in letteratura 
sembra plausibile ritenere che l'assemblaggio sopramolecolare 
dell'eparina plasmatica endogena con proteine o con fosfolipidi abbia la 
funzione di regolarne l'attività biologica e rendendo, allo stesso tempo, 
difficoltose la sua estrazione e la sua purificazione. Dato che 
l'associazione dei peptidi con l'eparina permane anche dopo esaustiva 
proteolisi del plasma, appare evidente che tale associazione è 
estremamente stabile e potrebbe avere un ruolo fisiologico.(6) 
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1.2 FUNZIONI FISIOLOGICHE E                  
PATOLOGICHE DELL’EPARINA 
 
L’eparina è presente in molti organismi animali, sia vertebrati che 
invertebrati, inclusi molluschi, anellidi, aracnidi, insetti ed anche animali 
antichissimi come i celenterati (7,8,9). Ciò suggerisce che l’eparina 
abbia un ruolo significativo di carattere generale nella fisiologia dei 
tessuti animali. L’attività biologica si esplica attraverso il legame con 
particolari proteine mediante interazioni elettrostatiche fra le cariche 
negative dell’eparina (portate sia dai gruppi carbossilici, sia dai gruppi 
solfato) e i residui basici (arginina, lisina) (10) delle proteine a livello di 
ristretti domini. Oltre a svolgere diversi ruoli in ambito fisiologico 
(principalmente nell’ambito della regolazione dell’emostasi e 
nell’interazione con fattori di trascrizione), l’eparina e’ anche coinvolta 
in processi patologici, tra i quali risulta di particolare rilevanza 
l’aterogenesi. 
 
1.2.1  Eparina ed emostasi 
La coagulazione del sangue si verifica quando si ha un danno 
vascolare. 
 Il fenomeno dell’emostasi è molto complesso e coinvolge un gran 
numero di enzimi, cofattori, ioni calcio e fosfolipidi; si realizza 
attraverso una cascata di reazioni, nelle quali una serie di proenzimi 
sono convertiti in serino-proteasi attive.  
L’eparina è un importante effettore del sistema emostatico. 
 Come evidenziato in figura 3, la coagulazione può svolgersi 
attraverso due vie distinte, la via intrinseca e la via estrinseca.  
 
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Figura 3.  La cascata della coagulazione 
 
 
Il sistema intrinseco è mediato da componenti del plasma ed è un 
processo relativamente lento rispetto al sistema estrinseco che è attivato 
dal rilascio di un fattore tissutale, detto tromboplastina, dalle cellule del 
tessuto danneggiato. 
 Le due vie, successivamente, convergono in un’unica via che 
conduce alla formazione del fattore Xa (X attivato), che si assembla con 
il fattore Va (V attivato) sulla superficie delle piastrine, convertendo la 
protrombina (fattore II) in trombina (IIa). Quest’ultima agisce sul 
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fibrinogeno portando alla formazione di fibrina solubile, che una volta 
stabilizzata dal fattore XIII, forma, con le piastrine aggregate, il tappo 
emostatico.(11)  
L’eparina esplica la sua funzione anticoagulante tramite interazione 
elettrostatica con l’antitrombina III (ATIII) (12,13) a livello dei residui 
di lisina 114 e 125 ed una specifica sequenza pentasaccaridica 
dell’eparina.  
            
 
Figura 4.   Formula di struttura del pentasaccaride 
 
 
L’ATIII è in grado di inibire diverse serino-proteasi coinvolte nel 
processo coagulativo, come i fattori IXa, Xa, XIa, XIIa, comportandosi 
da substrato “suicida”, in quanto interagisce con i siti attivi delle proteasi 
e viene da queste tagliata. 
 L’ATIII agisce anche da sola, ma una concentrazione ottimale di 
eparina aumenta da 1.000 a 10.000 volte la velocità della reazione.  
Il ruolo dell’eparina è quello di servire da stampo, sul quale si 
legano sia l’antitrombina che le proteasi. Questo legame determina una 
modificazione conformazionale dell’ATIII rendendo il sito reattivo più 
accessibile alle proteasi. Una volta che si è avuta la formazione del 
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trimero, eparina-ATIII-trombina, l’eparina si stacca ed è disponibile per  
catalizzare una nuova reazione. 
            
Figura 5:   Modello interazione dell’eparina con l’antitrombina III, il    fattore  Xa  la      
trombina.        
    
               
 
1.2.2 L’eparina ed il processo di aterosclerosi 
 
L'aterosclerosi è un processo patologico, gradualmente progressivo, 
a carico delle arterie che porta alla progressiva occlusione del lume del 
vaso.  
Questa patologia è caratterizzata dall'ispessimento dell'intima 
associato alla presenza di tipiche alterazioni dette ateromi.  
Sia la formazione che l'ulteriore evoluzione dell'ateroma avvengono 
lentamente e si svolgono attraverso tappe successive:  
 
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Figura 6: Aspetto macroscopico dell’aterosclerosi aortica: A) lieve  B) severa 
 
 
 
inizialmente si verifica la formazione di strie lipidiche costituite da 
macrofagi che hanno fagocitato LDL (cosiddette cellule schiumose). 
 L'intima, in corrispondenza delle strie lipidiche si ispessisce 
progressivamente per la proliferazione di cellule muscolari lisce e per 
deposizione di fibrina fino a dar luogo alla formazione di placche 
fibrose. Le strie lipidiche non sporgono nel lume in maniera significativa 
e di conseguenza non determinano di per sé ostacoli al flusso sanguigno. 
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Figura 7. Aorta di un paziente con strie lipidiche (frecce) 
                
          Durante l’evoluzione patologica le placche fibrose divengono 
una struttura rilevata in corrispondenza del lume arterioso e risultano 
formate da ammassi di fibrocellule muscolari lisce proliferanti e di 
macrofagi con citoplasma turgido di materiale fagocitato (LDL). 
L'ateroma rappresenta l’ulteriore evoluzione della placca fibrosa e si 
distingue da questa per la presenza di aree di necrosi. Esse sono causate 
dal diminuito apporto di ossigeno e di sostanze nutritive alle cellule 
dell'ateroma che negli stadi finali della malattia può andare incontro a 
calcificazione.  
               
Figura 8: Sezione istologica di una placca aterosclerotica: 
                    L (lume)  F (cappa fibrosa)  C (nucleo lipidico)