Le proprietà fotochimiche e biochimiche del fitocromo

Il fitocromo è un pigmento proteico con una massa molecolare di circa 125 kDa. I primi dati riguardo al ruolo del fitocromo nello sviluppo vegetale giunsero da studi iniziati negli anni '30 sulle risposte morfogeniche indotte dalla luce rossa, con particolare riguardo alla germinazione dei semi. Un momento fondamentale nella storia del fitocromo fu la scoperta che gli effetti della luce rossa (650-680 nm) sulla morfogenesi potevano essere rovesciati da una successiva irradiazione mediante luce di una lunghezza d'onda maggiore (710-740 nm), definita luce nel rosso lontano. La prima osservazione, fatta nel 1935, fu che la germinazione dei semi di lattuga è stimolata dalla luce rossa ed è inibita da quella nel rosso lontano. Tuttavia la vera scoperta fu fatta nel 1952, quando i semi di lattuga furono sottoposti ad esposizioni alternate di luce rossa e ne rosso lontano. Quasi il 100% dei semi che ricevevano luce rossa come trattamento finale germinavano, mentre nei semi in cui il trattamento finale era con luce del rosso lontano la germinazione era fortemente inibita. Questo esperimento dimostrava che le risposte alla luce rossa e rosso lontano non erano semplicemente opposte, erano anche antagoniste. Più tardi, si scoprì l'esistenza di un singolo pigmento che poteva esistere in due forme interconvertibili, una che assorbe la luce rossa e l'altra quella nel rosso lontano. Infatti, in piante cresciute al buio o eziolate il fitocromo è presente nella forma che assorbe la luce rossa, riferita come forma Pr. Questa forma è convertita dalla luce rossa nella forma che assorbe la luce nel rosso lontano detta forma Pfr. Quest'ultima forma, a sua volta, può essere riconvertita dalla luce nel rosso lontano in quella Pr. Questa capacità di fotoreversibilità è la proprietà più distintiva del fitocromo e può essere misurata in vivo e in vitro. È importante notare che il pool di fitocromo non è pienamente convertito nelle forme Pr o Pfr a seguito di irradiazione con luce. Così quando le molecole di Pr ricevono la luce rossa la maggior parte di esse la assorbirà e verrà convertita nella forma Pfr, ma alcune delle molecole Pfr assorbiranno anche la luce rossa e saranno riconvertite in Pr. Infatti, la porzione di fitocromo nella forma Pfr sottoposto a irradiazione saturante con luce rossa è solo del 85%. Allo stesso modo la piccolissima quantità di luce nel rosso lontano assorbita dal Pr rende impossibile convertire completamente il Pfr in Pr con una luce a largo spettro nel rosso lontano, anche se si raggiunge un equilibrio costituito dal 97% da Pr e dal 3% dal Pfr. Questo equilibrio, o meglio, questa sovrapposizione dello spettro di assorbimento delle due forme nella regione del rosso dello spettro è definita stato fotostazionario.
Oltre ad assorbire la luce rossa entrambe le forme di fitocromo assorbono anche nella regione blu dello spettro. Quindi gli effetti del fitocromo possono anche essere stimolati dalla luce blu, che può convertire il Pr in Pfr e viceversa. Comunque, nelle piante la varietà di risposte del fitocromo è enorme, in termini sia dei tipo di risposte che di qualità della luce necessaria per indurle. Le risposte morfologiche della fotoattivazione del fitocromo possono essere visivamente osservate dopo un tempo di ritardo (lag time), il tempo che intercorre fra la stimolazione e l'osservazione della risposta. Il lag time può essere breve, come pochi minuti o lungo, alcune settimane. Le più rapide fra queste risposte sono di solito i movimenti reversibili degli organuli o i cambiamenti reversibili delle cellule (rigonfiamento, restringimento), ma avvengono in fretta anche alcune risposte di crescita. Lag time di numerose settimane si osservano, invece, nell'induzione della fioritura. Tuttavia, come dicevamo, le risposte del fitocromo possono essere distinte anche dalla quantità di luce necessaria per indurle. Questa quantità è riferita come fluenza ed è definita come il numero di fotoni che colpiscono un'unità di area di superficie e si misura in micromoli di quanti per metro quadrato (μmol m-2). Oltre alla fluenza, alcune risposte del fitocromo sono sensibili alla irradiazione, o velocità di fluenza della luce. Ogni risposta del fitocromo possiede una gamma caratteristica di fluenze di luce nelle quali la grandezza della risposta è proporzionale alla fluenza; abbiamo tre categorie, basate sulla quantità di luce necessaria:
1) Risposte a fluenza bassissima (VLFR). Alcune risposte del fitocromo possono iniziare con fluenze basse fino a 0,0001 μmol m-2 e vanno a saturazione (cioè raggiungono il massimo) a circa μmol m-2, esse non sono fotoreversibili. Ad esempio i semi di Arabidopsis possono essere indotti a germinare con la luce rossa della gamma da 0,001 a 0,1 μmol m-2. Questo piccolo quantitativo di luce necessario per indurre una  VLFR converte meno dello 0,02% del fitocromo totale in Pfr. Poiché la luce nel rosso lontano che normalmente invertirebbe un effetto dovuto alla luce rossa converte il 97% del Pfr in Pr, circa il 3% del fitocromo rimane nella forma Pfr, molto di più di quanto richiesto per indurre una VLFR. Il altre parole, la luce nel rosso lontano non è in grado di diminuire la concentrazione del Pfr sotto lo 0,02%, così è incapace di inibire la VLFR;
2) Risposte a fluenza bassa (LFR). Un altro gruppo di risposte del fitocromo non possono aver inizio fino a quando la fluenza non raggiunge il valore di 1,0 μmol m-2 e sono saturate a 1000 μmol m-2). Queste risposte comprendono la maggior parte delle classiche risposte fotoreversibili rosso/rosso lontano, come l'induzione della germinazione nei semi di lattuga e la regolazione dei movimenti della foglia. Sia VLFR che LFR possono essere indotti da brevi impulsi di luce, a patto che la quantità totale di energia luminosa si sommi alla fluenza richiesta. La fluenza totale è in funzione di due fattori: la velocità di fluenza e il tempo di irradiazione. Così un breve impulso di luce rossa indurrà una risposta se la luce sarà sufficientemente intensa e, per contro, una luce molto bassa avrà un effetto se il tempo di irradiazione sarà sufficientemente lungo. Questa relazione reciproca fra la velocità di fluenza e il tempo è nota come legge di reciprocità, cioè la grandezza della risposta (per esempio la percentuale di germinazione o il grado di inibizione dell'allungamento dell'ipocotiledone) dipende dal prodotto della velocità per il tempo di irradiazione;
3) Risposte ad elevata irradiazione (HIR). Queste risposte (per esempio produzione di etilene nel sorgo, sintesi di antocianine in varie dicotiledoni etc.) richiedono elevate esposizioni continue e prolungate ad una luce con irradiazione relativamente elevata e, entro certi limiti, la risposta è proporzionale alla irradiazione fino a quando la risposta va a saturazione e ulteriore luce non ha più effetto. La ragione per la quale queste risposte sono definite ad alta irradiazione e non ad alta fluenza è che sono proporzionali più alla luminosità della fonte luminosa (irradiazione) che alla fluenza. Le HIR vanno a saturazione a fluenze più elevate delle LFR (almeno cento volte maggiori), non sono fotoreversibili e non rispettano la legge di reciprocità.
Bisogna dire, infine, come precedentemente detto, che il fitocromo è coinvolto anche nel fotoperiodismo, ossia nella capacità di misurare la lunghezza del giorno (lunghezza del periodo di luce/lunghezza del periodo di buio nelle 24 ore), quindi nel controllo della fioritura. In questo modo possiamo distinguere piante brevidiurne (SDP), in cui la fioritura avviene solo dopo esposizione a giorni brevi e notti lunghe (è il caso del riso, fragola, crisantemo etc), piante longidiurne (LDP), in cui la fioritura avviene solo dopo esposizione a giorni lunghi e notti brevi (è il caso dello spinacio, avena, barbabietola etc.) e piante neutrodiurne, in cui la fioritura non è determinata dalla lunghezza del giorno (è il caso della patata, mais , fagiolo, pomodoro etc.). Quindi la pianta misura la lunghezza della notte.