Ruolo dei peptidi cerniera nella formazione di dimeri non-covalenti della ribonucleasi bovina pancreatica mediante scambio di domini strutturali

Il meccanismo di formazione di strutture oligomeriche a partire da forme monomeriche, in seguito a scambio di domini strutturali tra subunità, prende il nome di 3D-domain swapping. La regione di contatto in cui si hanno le interazioni tra il dominio scambiante e il corpo della proteina, presente sia nella forma monomerica sia in quella oligomerica scambiante, costituisce la cosiddetta interfaccia chiusa, mentre la regione di interazione tra le subunità proteiche, presente nell’ oligomero scambiante e assente nella forma monomerica, costituisce l’ interfaccia aperta. Il segmento peptidico che connette il dominio scambiato al corpo principale della molecola proteica assume il nome di “peptide cerniera”. Un sistema modello ideale per la comprensione del fenomeno dello scambio di domini strutturali con trasformazione monomero→dimero, è rappresentato dalla famiglia delle ribonucleasi di tipo pancreatico.Studi sperimentali hanno mostrato che l’RNAsi A in condizioni blandamente denaturanti tende a generare diverse forme oligomeriche scambianti, tra cui due dimeri, uno (DN) derivante dallo scambio dell’elica N-terminale mediato dal peptide cerniera 16-22 e l’altro (DC) derivante dallo scambio del β-strand C-terminale, che è regolato dal peptide cerniera 111-115. Questo lavoro di tesi si inserisce in un progetto di ricerca che prevede l’analisi dell’effetto della sequenza e della lunghezza del peptide cerniera sulla formazione di dimeri non-covalenti della ribonucleasi bovina pancreatica e prevede la cristallizzazione e la caratterizzazione strutturale del dimero C-terminale P114A-RNAsi A e di des(16-20) RNasi A..Il dimero di P114A è stato ottenuto per sostituzione della prolina in posizione 114 della RNAsi A con un residuo di alanina.La struttura cristallografica di DC-P114A-RNasi A presenta lo scambio reciproco tra le subunità del β-strand C-terminale ed assume una struttura quaternaria molto simile a quella del dimero C-terminale dell’enzima nativo, ad eccezione di una leggera variazione conformazionale globale, dovuta essenzialmente all’elevata flessibilità della struttura quaternaria tipica dei dimeri scambianti. Nella RNasi A il passaggio monomero→dimero C-terminale comporta la transizione cis-trans del legame peptidico 113-114. La sostituzione di Pro114 con Ala, mirava a verificare l’effetto della presenza nel peptide cerniera di un residuo per il quale la conformazione cis è meno preferita nel processo di dimerizzazione. I risultati ottenuti dallo studio della cinetica di dimerizzazione per il mutante P114A indicano che, rispetto alla proteina nativa, si ha una riduzione della percentuale del dimero DC nella miscela ottenuta per liofilizzazione della proteina da HAc 40. Il rapporto tra il monomero e la quantità totale di proteina dimerizzata è invece invariato rispetto alla proteina nativa. Questo risultato indica che la capacità di scambio del mutante rispetto alla proteina nativa è inalterata ma la sostituzione Pro-114-Ala favorisce inaspettatamente lo scambio dell’estremità N-terminali. Una possibile spiegazione dei dati sperimentali si ha esaminando il ruolo del solvente strutturato nella stabilizzazione del folding della ribonucleasi A. Una caratteristica strutturale ampiamente conservata nelle numerose strutture cristallografiche della RNasi A è la presenza di alcune molecole di acqua che tengono vincolato il dominio C-terminale a quello N-terminale della proteina. Nella struttura cristallografica del mutante mP114A mancano le interazioni che coinvolgono il sito di mutazione: è come se la sostituzione Pro-114-Ala avesse in parte indebolito le interazioni all’interfaccia tra le due estremità della proteina. Il minore vincolo strutturale associato alle regioni terminali di mP114A, insieme alla flessibilità intrinseca delle regioni cerniera, potrebbe giustificare infatti la percentuale paragonabile dei due dimeri. Des(16-20)RNAsi A è stato ottenuto per delezione di 5 residui (16-20) nella sequenza del peptide cerniera di RNasi A e viene purificata direttamente cin forma dimerica. E’ stato recentemente mostrato che l’eliminazione del peptide 16-20 in un’altra ribonucleasi monomerica di tipo pancreatico, la ribonucleasi umana [(des16-20) HP-RNasi], destabilizza completamente il folding della forma monomerica. La proteina viene infatti purificata direttamente come dimero scambiante di cui recentemente è stata determinata la struttura cristallografica. L’affinamento della struttura è ancora in corso. Il modello ottenuto mostra che ciascun dimero è caratterizzato dallo scambio dell’elica N-terminale (residui 1-15) mediato dal peptide (16-22) cerniera privato dei residui 16-20. È stata inoltre messa in evidenza la presenza di due molecole di dimero nell’unità asimmetrica con struttura quaternaria leggermente diversa. L’ architettura dei due dimeri è molto simile a quella di des(16-20) HP-RNasi ma, molto diversa rispetto agli altri dimeri non covalenti di ribonucleasi.