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Manipolazione di cellule mediante dielettroforesi: nuove applicazioni nella tecnologia “Lab-on-a-chip”

L’odierno sviluppo della tecnologia Lab-on-a-chip (LOAC) sta riscuotendo notevole successo in vari ambiti scientifici e di ricerca, dall’oncologia predittiva alla diagnostica biomedica, dallo studio di farmaci alla ricerca in biologia cellulare. Sulla base del fenomeno fisico della dielettroforesi (DEP) sono stati costruiti dispositivi LOAC in grado di manipolare microsfere, microrganismi e cellule eucariotiche, con una risoluzione di singola bioparticella, cioè ad un livello di selettività e specificità pressoché massimo. Ciò ha consentito di superare molti dei limiti (risolutivi, temporali, economici e pratici) della strumentazione attualmente presente sul mercato e finalizzata alla manipolazione di cellule.
Le capacità dei biochip a base dielettroforetica sono enormi. In questo lavoro di tesi sono state esaminate le potenzialità applicative del dispositivo dielettroforetico DEPArray™ (prodotto da Silicon Biosystem s.p.a., Bologna, Italia), un biochip che, grazie alle sue peculiarità costruttive e strutturali, sembra essere idoneo allo sviluppo di nuovi protocolli sperimentali e metodologie per la movimentazione selettiva di cellule eucariotiche.
In particolare, in questo lavoro di tesi sono state messe a punto metodiche e protocolli sperimentali finalizzati alla: a) movimentazione selettiva di cellule tra compartimenti; b) eliminazione selettiva di cellule; c) manipolazione e rivelazione selettiva di cellule sanguigne.
In riferimento alla movimentazione di cellule tra compartimenti, è stato messo a punto un protocollo sperimentale di lavaggio ed incubazione di cellule in assenza di centrifugazione e con risoluzione di singola cellula (definito flow-less centrifugation-free washing and incubation). Inoltre, in riferimento alla possibilità di eliminare selettivamente singole cellule da una popolazione cellulare di grandi dimensioni, è stata determinata l’effettiva applicabilità della dielettroforesi ad alta frequenza nella lisi cellulare selettiva. Infine, in riferimento alla manipolazione e rivelazione di cellule sanguigne, è stato studiato il comportamento dielettroforetico di eritrociti, piastrine e linfociti/monociti. In particolare, è stato dimostrato che tali cellule del sangue possono essere mosse secondo tempi e modalità differenti sotto le stesse condizioni dielettroforetiche di voltaggio. Infine, utilizzando le informazioni derivanti dall’analisi dei segnali ottici acquisiti mediante appositi biosensori integrati nel DEPArray™, è stato possibile determinare sostanziali differenze nelle tre popolazioni di eritrociti, piastrine e linfociti/monociti sulla base di alcuni parametri di misura, come la variazione del livello di grigio (∆ grey level), il tempo di attraversamento del sensore da parte della cellula (∆t crossing) ed il tempo intercorrente fra l’inizio dell’acquisizione del segnale e il raggiungimento del picco massimo (T peak). Questo risultato è particolarmente interessante in quanto essenziale per la messa a punto di un sistema di rilevazione qualitativo e quantitativo per la identificazione e diversificazione dei vari tipi cellulari sanguigni. In prospettiva, tale risultato apre la strada all’allestimento di un LOAC per rapide ed economiche analisi emocitometriche.

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Introduzione 3 1. INTRODUZIONE L'avvento della tecnologia “Lab-on-a-chip” (abbreviato con LOAC 1 ) (Chovan e Guttman, 2002; Kricka, 2001) assicura il realizzabile controllo della manipolazione di singoli oggetti biologici, tra cui acidi nucleici, proteine, cellule, ecc. (Mouradin, 2002; Burns et al., 1996; Dill et al., 2001; Fuchs et al., 2002; Lockhart e Winzler, 2000; Sanders e Manz, 2000; Schena et al., 1998; Swanson et al., 2000; Thewes et al., 2002; Xue et al., 2002; Xu et al., 2003; Mastrangelo et al., 1998), superando i limiti dei metodi attuali. Tale tecnologia si propone di mettere a punto test di laboratorio da trasferire soprattutto ad ambienti “non laboratoristici” (Weigl e Hedine, 2002) (Fig. 1.1). Fig. 1.1. Attuale utilizzo della tecnologia “Lab-on-a-chip”. Le percentuali indicate si riferiscono alle quote attuali di produzione dei biochips. Nell’ambito di questo settore, la messa a punto di sistemi per la micromanipolazione di cellule costituisce un obiettivo rilevante, soprattutto in funzione della sua applicabilità in molti campi quali diagnosi, ricerca biomedica, caratterizzazione fenotipica e sviluppo di farmaci (Gambari et al., 2003). Ancor più interessante è, in questo contesto, la possibilità di micromanipolare singolarmente una cellula. Infatti, le poche tecniche di laboratorio utilizzate ad oggi per la manipolazione individuale di cellule (come, ad esempio, la microdissezione e la diluizione limite) sono lunghe, laboriose e spesso non applicabili a tutti i tessuti di interesse. Sotto il profilo della manipolazione cellulare, la tecnologia LOAC, che concentra la miniaturizzazione di un numero complesse di procedure chimiche e/o fisiche in una singola piattaforma disposta su un microchip, rappresenta in prospettiva una risorsa molto interessante (Manaresi et al., 2003) (Fig. 1.2). 1 letteralmente tradotto come “Laboratorio su un Chip”, è stato coniato per designare strumenti di dimensioni ridottissime in grado di effettuare analisi di laboratorio direttamente sulla superficie di un singolo circuito integrato.

Laurea liv.II (specialistica)

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Giovanni Tedesco Contatta »

Composta da 87 pagine.

 

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Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.