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Individuazione rapida di Bacillus licheniformis mediante PCR

N.B. Nota redazionale: per le immagini della tesi non inserite nel testo pregasi rivolgersi all'autrice.

B. licheniformis è una specie batterica che riveste notevole importanza nell’industria fermentativa: è infatti il principale produttore di amilasi e proteasi commerciali. Da alcuni anni, inoltre, viene ritenuto un possibile ospite per l’espressione di geni clonati che codificano per la sintesi di prodotti di interesse agro-alimentare e industriale. Ne consegue che la ricerca di metodi sensibili, specifici e rapidi che ne consentano l’individuazione è sempre più richiesta e più approfondita.
In questo lavoro sono stati studiati 184 isolati, provenienti da svariati campioni di suolo e provvisoriamente ascritti alla specie B. licheniformis. Ricerche recentemente svolte nel nostro laboratorio e basate sulla tecnica RAPD, avevano permesso di raggruppare gli isolati che presentavano un profilo elettroforetico uguale o simile in 30 cluster. Successivamente, è stato valutato il grado di ibridazione molecolare DNA/DNA di un rappresentante per ciascun cluster rispetto al ceppo type di B. licheniformis. E’ risultato che 25 cluster, attraverso il proprio rappresentante, presentano un elevato seppur diverso grado di omologia genetica (70-100%) con il ceppo type di B. licheniformis. I restanti 5 cluster possedevano un più basso valore di riassociazione DNA/DNA (0-35%). Questi risultati, se da un lato confermano l’appartenenza a B. licheniformis della maggior parte dei ceppi studiati, d’altro canto mettono in evidenza la decisa biodiversità all’interno della specie B. licheniformis, tant’è che i profili elettroforetici della RAPD erano simili ma non uguali, salvo alcune eccezioni. Inoltre, stante la procedura adottata, nessuna banda di DNA risultava essere comune a tutti i ceppi.
Quindi la RAPD consente di evidenziare la biodiversità dei ceppi di B. licheniformis, ma, poichè si utilizzano primer costituiti da sequenza casuale, non ha sufficiente potere discriminante per poter essere utilizzata nella individuazione a livello di specie di isolati differenti. Stante questo fatto, si è voluto allora mettere a punto una procedura sempre basata sulla “reazione a catena della polimerasi” (PCR), ma più mirata, al fine di ottenere una banda tipica, peculiare e propria della specie B. licheniformis. Dapprima si è proceduto a verificare se esistevano uno o più geni caratteristici di B. licheniformis e, di questi geni, se era nota la sequenza nucleotidica. Da un primo esame sembrava che il gene della ciclodestrin glucosiltransferasi (cgtA) potesse essere il gene da noi ricercato. Scelta quindi una sequenza di 257 paia di basi (bp) da amplificare, e fatti costruire i relativi primer, si è proceduto alla amplificazione di detta frazione. Purtroppo, però, l’amplificazione del gene nei 60 isolati saggiati si è rivelata aspecifica. Una successiva più approfondita ricerca, anche con l’ausilio di una banca dati, ha condotto alla scelta del gene che codifica per il repressore della xilulosio-isomerasi (xylR). Anche in questo caso, scelto un frammento del gene di 193 bp, costruiti i due primer specifici, si è proceduto all’amplificazione del frammento. Questa volta l’amplificazione non è stata svolta in modo arbitrario ma, considerando validi i risultati della precedente RAPD, sui rappresentanti dei 30 cluster.
E’ risultato che i rappresentanti dei 25 cluster che possedevano un DNA con elevata omologia genetica nei confronti del ceppo type possedevano tutti la frazione del gene xylR. Per contro, i rappresentanti dei rimanenti 5 cluster, dove erano stati riuniti i ceppi a basso grado di omologia genetica, non mostravano di possedere la suddetta frazione del gene xylR. Questo risultato è un’ulteriore dimostrazione che i componenti di questi ultimi cluster non possono essere ascritti alla specie B. licheniformis.
Per avere una ulteriore conferma del valore discriminante della procedura adottata, è stato fatto il confronto con il DNA di altre 11 specie di Bacillus e di altre 7 specie di batteri non sporigeni, sia G+ che G-. La comparazione dei profili elettroforetici dei prodotti di amplificazione della frazione del gene xylR non è stata positiva in nessuna delle 18 specie saggiate.
Al momento quindi possiamo ritenere che il gene xylR abbia una sequenza nucleotidica specifica e apparentemente esclusiva di B. licheniformis, sicché viene considerato un potenziale candidato per ottenere sonde specifiche per l’individuazione di B. licheniformis eventualmente presenti in matrici anche complesse, come possono essere gli alimenti e il suolo.

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6 1.1 : Il genere Bacillus I batteri che appartengono al genere Bacillus sono microrganismi catalasi positivi a forma di bastoncino diritto, per lo più mobili per ciglia peritriche (1). Pur avendo la parete cellulare caratteristica dei Gram positivi, molti reagiscono alla colorazione in modo variabile o negativo, soprattutto durante la fase stazionaria di crescita. La colorazione di Gram ha quindi limitato valore tassonomico per questo gruppo (1). Sono aerobi in grado di utilizzare come substrato per la respirazione aerobia un gran numero di composti organici (zuccheri semplici, polisaccaridi, aminoacidi, proteine, acidi organici); alcuni sono anaerobi facoltativi e fermentano i carboidrati. Alcune specie richiedono fattori di crescita (vitamine del gruppo B e aminoacidi). Alcuni sono in grado di compiere una respirazione anaerobia utilizzando i nitrati come ultimo accettore di elettroni. Alcune specie sono pure in grado di fissare l’azoto atmosferico. In condizioni aerobie sono in grado di formare endospore cilindriche o ellissoidali in posizione centrale, subterminale o terminale, distinzioni usate in tassonomia. La possibilità di sporificare li rende resistenti a radiazioni UV e ionizzanti, al calore e a svariati composti tossici; in virtù di questa capacità, le spore possono mantenere anche per decenni il potenziale germinativo (1). Pur essendo quasi tutti mesofili, alcuni sono in grado di crescere anche in condizioni estreme (1); questa possibilità, insieme alla capacità di vivere in carenza di ossigeno degli anaerobi facoltativi, fa sì che il genere sia praticamente ubiquitario. Infatti, pur avendo il suolo come habitat preferenziale, sono stati isolati dei Bacillus dalle matrici più disparate: dai cibi, dagli animali, dalle sorgenti termali (2). Diverse specie di Bacillus rappresentano da molti anni la principale fonte di prodotti commerciali ottenuti attraverso processi fermentativi (vedi Tabella 1). Anche senza approfondite conoscenze sulla genetica dei ceppi di questo genere, microrganismi come B. licheniformis e B. amyloliquefaciens sono stati migliorati attraverso

Tesi di Laurea

Facoltà: Agraria

Autore: Daniela Mosca Contatta »

Composta da 104 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 4615 click dal 20/03/2004.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.