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Studio sulla proteina MsmDnaB1: una nuova inteina di classe 3

L’elaborato di tesi ha come oggetto la caratterizzazione strutturale di una nuova proteina recentemente scoperta appartenente alla famiglia proteica delle Inteine. Le inteine sono delle proteine in grado di mediare reazione di splicing, un processo post-traduzionale che consiste nella ricombinazione di due frammenti proteici chiamati esteine e l’esclusione della proteina in esame appunto l’inteina; si dividono i tre classi in base alle differenze nel meccanismo di splicing. In campo biotecnologico le inteine sono utilizzate per la purificazione di proteine ricombinanti utilizzando le inteine come tag e per le reazioni di IPL (Intein-Mediated Protein Ligation) cioè reazione tra peptidi sintetici e non con proteine sfruttando la capacità di mediare splicing delle stesse inteine, come anche nel caso precedente. L’ inteina che ho studiato è stata denominata MsmDnaB1 ed è stata attribuita alla classe 3, una classe di cui il tipo di meccanismo di spilcing non è stato ancora definito. Nel mio lavoro di tesi abbiamo cercato di definire la struttura secondaria di MsmDnaB1 mediante l’introduzione di mutazioni nella sequenza genica e utilizzando tecniche spettroscopiche, abbiamo valutato sia la compromissione della stessa struttura dopo reazione di splicing ,effettuando anche studi comparativi con inteine di classe diverse già caratterizzate, e sia le modificazioni (rallentamenti) nella cinetica di splicing, infine abbiamo individuato uno step importante che caratterizza la reazione di splicing delle inteine di classe terza mediante metodiche di digestione enzimatica e analisi LC-MS.

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1 1. Introduzione 1.1 Le Inteine Le Inteine sono proteine composte da un numero di amminoacidi molto variabile, compreso tra 128 e 800 definite anche introni di proteine (in analogia agli introni di RNA) grazie alla loro capacità di mediare un processo di splicing(Y. Anraku et al. 2009) (Figura 1.1-1). Ad oggi non è noto il ruolo biologico di queste proteine; il fatto che esse siano state ritrovate in tutti e tre i domini filogenetici (eucarioti, archea, procarioti) suggerisce che losplicingproteicoabbia unaantica origineevolutiva (Liu XQ, Annu Rev Genet.2000). Le inteinesono state ritrovate inproteinecon funzionidiverse,tra cuienzimi metabolici, DNA e RNA polimerasi, proteasi, ribonucleotideriduttasie ATPasi ditipovacuolare (Bowman EJ et al. J Biol Chem. 1988). Tuttavia,gli enzimicoinvolti nella replicazionee riparazione del DNAsembrano essere piø ricchi di inteine. (Gogarten et al.BMC Evol Biol 2006). La distribuzione filogenetica delleinteineè sporadica(Pietrokovski S. Trends in Genetics 2001) (Figura 1.1-2). La presenza di uninteinain un particolare genenon significa necessariamenteche unomologaesteinadauna specie simileo ceppoavrà la stessa inteina. In questo momento,non è chiarose il modello didistribuzione delle inteinerappresentila perdita diinteineantiche oacquisizionipiørecentidiinteinea causa dellamobilità del gene stesso. In molti casianalizzati,il “codonusage”ed il contenutoGCdelleinteineè diverso dallaregioneesteina circostante,suggerendo unarecentetrasmissione orizzontale.Organismi che hannoun gran numero diinteinepossono averle acquisite perchØ(1) possono facilmente prendereil DNAdall'ambiente(naturalmentecompetente), (2) per la presenza di virus inazione,elementidi coniugazione, plasmidi ecc. che hannoampicampi diaccoglienza,o (3)perchØ ci sonoefficientimacchinari di conversione genica e supporto, sistemi di riparazionerotturee /o sistemi diricombinazione(Liu XQ, Annu Rev Genet.2000). La prima inteina è stata scoperta nell'enzima ATPasi dei vacuoli del lievitoS. cerevisiae(Hirata 1990, Kane 1990). Fu trovato infatti un inserimento in frame nel gene VMA1; la sequenza nucleotidica del gene faceva prevedere che la proteina corrispondente fosse composta da 1071 amminoacidi per un peso di circa 118 kDa, ma di fatto la proteina che si otteneva aveva una dimensione di 67 kDa. Le sequenze amminoacidiche nelle regioni C- e N- terminale della proteina erano molto simili alle

Laurea liv.II (specialistica)

Facoltà: Scienze Biotecnologiche

Autore: Vincenzo Pilato Contatta »

Composta da 77 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 900 click dal 21/02/2012.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.