L'impiego del metodo del Reverse Dot Blot per la diagnosi molecolare della Fibrosi Cistica

Il lavoro di tesi approfondisce la fibrosi cistica, la più comune delle malattie genetiche gravi soffermando l’attenzione su un importante metodo diagnostico, il Reverse Dot Blot.
La fibrosi cistica è una malattia autosomica recessiva che colpisce principalmente i polmoni, il pancreas e l’apparato intestinale. La fibrosi cistica è diffusa in tutto il mondo e fu descritta per la prima volta nel 1938, ma solo nel 1989 fu scoperto il gene CFTR.
Il CFTR è il gene responsabile della fibrosi cistica, che si manifesta quando vi sono due copie mutate del gene. Il gene CFTR codifica la proteina CFTR, Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator, ovvero il regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica. La proteina CFTR in condizioni normali è localizzata sulla membrana apicale di molte cellule epiteliali ed agisce come canale per il trasporto di ioni, in particolare il cloro.
La fibrosi cistica è una malattia molto eterogenea, infatti l’entità dei sintomi e il decorso sono molto variabili. Ciò deriva dalle numerosissime mutazioni che possono colpire il gene CFTR; fino ad oggi se ne conoscono più di 1800. Esse pur essendo molto eterogenee sono state suddivise in cinque classi, in relazione alle alterazioni di struttura e di funzione che provocano nella proteina CFTR.
Attualmente non si può guarire dalla fibrosi cistica. Tuttavia numerosi sono stati i progressi della ricerca che ha permesso di aumentare l’aspettativa di vita dei malati , in particolare per le migliori terapie per le infezioni respiratorie ed oggi è possibile tenere sotto controllo la malattia.
Il lavoro si focalizza sulla diagnosi della fibrosi cistica attraverso il metodo del Reverse Dot Blot, che rappresenta la tecnica maggiormente utilizzata nell’ambito dell’analisi molecolare. Si tratta di un metodo molto affidabile e rapido, anche se limitato all’identificazione di mutazioni note.
La tesi è articolata in cinque capitoli. Nel primo capitolo ho fatto un breve excursus storico della fibrosi cistica e ho riassunto le principali manifestazioni cliniche della malattia. Nella seconda parte del capitolo ho descritto in breve i vari metodi di diagnosi disponibili, sia prenatali che postnatali. Tra questi ricordiamo il test del sudore, comunemente utilizzato, il test della tripsina. Nell’ambito molecolare possiamo ricordare soprattutto il Reverse Dot Blot.
Nel secondo capitolo ho discusso i principali tessuti bersagli della fibrosi cistica; ho descritto in primo luogo i tessuti epiteliali, focalizzando l’attenzione sui polmoni e sugli altri organi e tessuti più colpiti dalla malattia. Successivamente ho descritto le ghiandole a secrezione in particolare le ghiandole sudoripare. Infine, ho parlato dei canali ionici e della loro funzione.
Nel terzo capitolo ho puntato l’attenzione sulla struttura del gene CFTR, descrivendo la sua organizzazione, le dimensioni, la distribuzione di introni ed esoni. In seguito mi sono soffermata sulla struttura molecolare della proteina CFTR, sui vari domini funzionali e sul ruolo della proteina nella membrana cellulare.
Il quarto capitolo è incentrato sulle mutazioni che possono colpire il gene CFTR; ho descritto i vari tipi di mutazioni e la loro classificazione. Inoltre ho descritto alcune delle mutazioni più comuni, tra cui la ∆F508. Nell’ultima parte del capitolo ho parlato della correlazione tra genotipo e fenotipo.
Il quinto e ultimo capitolo racchiude l’argomento della tesi. Infatti mi sono soffermata sulla diagnosi molecolare della fibrosi cistica attraverso il metodo del Reverse Dot Blot. Nella prima parte ho parlato del principio del Southern Blot, in quando il Reverse Dot blot rappresenta una sua modificazione, ma è basato sugli stessi principi. Inoltre ho descritto le sonde molecolari e l’ibridazione radioattiva e non radioattiva. In seguito ho descritto il metodo del Reverse Dot Blot. Poi, ho fatto riferimento ad un esempio di protocollo usato in laboratorio diagnostico, riportando le varie fasi per l’esecuzione del metodo, i vari materiali e soluzioni utilizzati. Nell’ultima parte ho riportato delle figure ed ho fatto un’interpretazione dei risultati.