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Analisi filogenetica di norovirus responsabili di enterite sporadica infantile

La gastroenterite virale è un’infiammazione dell’apparato digerente che può essere causata da diversi virus e si manifesta con nausea, dolori addominali, diarrea e vomito. Questi ultimi sintomi possono causare un’ingente e rapida perdita di acqua, elettroliti e minerali. Nell’adulto l’evoluzione è benigna, ma i lattanti e i bambini sono soggetti alle complicanze, talora gravi, della disidratazione e necessitano spesso del ricovero in ospedale. Nei paesi in via di sviluppo la gastroenterite rappresenta un’importante causa di mortalità infantile.
I Norovirus (NoV) sono la causa più comune di epidemie di gastroenterite acuta in tutto il mondo e in tutte le fasce d’età e sono classificati come agenti microbici di categoria B dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases, in quanto altamente contagiosi, estremamente stabili, e altamente infettanti. Molti aspetti della fisiopatologia delle infezioni da NoV umani risultano ancora non chiari, a causa della mancanza di un sistema di coltura cellulare o di un modello animale. I NoV appartengono alla famiglia Caliciviridae e sono virus non inviluppati, con un genoma a RNA a singolo filamento a polarità positiva. Il genoma dei NoV presenta tre ordini di lettura (ORF): il primo ORF codifica per proteine coinvolte nella replicazione virale, il secondo ORF per la proteina VP1 e il terzo ORF per la proteina VP2. VP1 è responsabile del legame del virus ai suoi recettori cellulari (ABO, H, antigene di Lewis), e in base all’analisi filogenetica di questo gene è stato possibile sviluppare un sistema di classificazione che prevede 5 diversi genogruppi (da GI a GV); ulteriormente suddivisi in 33 cluster genetici o genotipi. I NoV che infettano l’uomo appartengono ai genogruppi I, II e IV. Il genotipo 4 del genogruppo II (GII.4) provoca la maggior parte delle epidemie di vomito invernale e mostra una peculiare capacità di andare incontro a frequenti cambiamenti genetici, determinando la comparsa di “varianti”. Ad oggi non esiste ancora un vaccino specifico per i NoV. L’utilizzo di particelle virus-like (VLP), antigenicamente e morfologicamente simili al virione nativo, sembra una strategia promettente per indurre una risposta immunitaria protettiva. L’obiettivo del nostro studio è stato quello di comprendere le dinamiche evolutive dei NoV attraverso la caratterizzazione molecolare dei ceppi circolanti a Palermo nel corso di 15 mesi.
Un totale di 596 campioni fecali di bambini di età <5 anni ricoverati presso l’Ospedale “G. Di Cristina” di Palermo sono stati raccolti nell’anno 2011 e nel primo trimestre del 2012. L’RNA virale è stato estratto, utilizzando il QIAmp Viral RNA Mini Kit (Qiagen), e retrotrascritto in cDNA. Il cDNA ottenuto è stato utilizzato per identificare la presenza del genoma di NoV mediante una reazione di Real-Time PCR. I campioni positivi in Real-Time PCR sono stati tipizzati tramite amplificazione e sequenziamento di ORF1 e ORF2. Infatti, l’analisi del gene RdRp, affiancata dall’analisi del gene del capside, è la migliore strategia per determinare genotipi e varianti di NoV. La determinazione del genotipo di appartenenza di ognuna delle sequenze geniche ottenute è stata effettuata tramite la banca dati della rete di sorveglianza europea Noronet. L’identificazione presuntiva così ottenuta è stata verificata attraverso un’analisi filogenetica.


Già nel passato la circolazione di NoV era stata indagata a Palermo. Nel 2004 i NoV erano stati riconosciuti come i più frequenti agenti di enterite virale in bambini ricoverati presso lo stesso ospedale oggetto del nostro studio e dimostrando inoltre la possibile coinfezione NoV-Rotavirus (Colomba et al., 2007). Negli anni 2005 e 2006, la prevalenza dell’infezione da NoV era stata del 15,8% e 28,9%, rispettivamente (Ramirez et al., 2009). Negli anni 2009-2010 sono stati identificati a Palermo ceppi ricombinanti GII.g/GII.12 (Giammanco et al., 2012).


Durante il periodo di sorveglianza è stata riscontrata la presenza di NoV in 140 campioni fecali su 596 esaminati (23,5%). La tipizzazione molecolare ha permesso di individuare la prevalente circolazione del genotipo GII.4 (75,6%), che includeva 4 ceppi con il genotipo ricombinante RdRp/VP1 GII.e/GII.4. Il GII.6 rappresentava il secondo genotipo (9,8%), seguito da GII.2 (7,3%), GI.4 (4,9%) e GII.7 (2,4%). All’interno del genotipo GII.4, la variante v2010 si mostrava prevalente ma era possibile evidenziare la presenza di tre distinti cluster di NoV GII.4 circolanti a partire dal 2011, per i quali è stata ipotizzata l’appartenenza a nuove varianti. Questo risultato è stato confermato dalla presenza di peculiari mutazioni puntiformi e dal calcolo delle percentuali di divergenza nucleotidica rispetto alle sequenze delle varianti GII.4 precedenti.

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6 I CALICIVIRUS I Calicivirus sono una famiglia di virus privi di envelope, di forma icosaedrica, contenenti un singolo filamento di RNA. Sulla base della sequenza genomica codificante per la proteina del capside VP60 è possibile distinguere all’interno della famiglia Caliciviridae 4 generi: Norovirus, Sapovirus, Lagovirus e Vesivirus [Lopman et al., 2002; Van Regenmortel et al., 2000]; i Lagovirus e i Vesivirus infettano solo gli animali come conigli, maiali, gatti e mammiferi marini; mentre i Norovirus e i Sapovirus infettano sia gli animali che l’uomo anche se una trasmissione diretta tra uomo e animale non è ancora stata dimostrata. I NOROVIRUS I Norovirus sono piccoli virus a RNA a struttura sferica e privi di envelope, hanno un genoma costituito da un RNA a singolo filamento di 7,7 Kb, a polarità positiva che presenta tre ordini di lettura (ORF) (Michele E. Hardy., 2005). Il primo ORF codifica per diverse proteine non strutturali importanti per la replicazione virale, ma che non vengono ritrovate nelle particelle virali, tra cui proteasi, RNA polimerasi RNA dipendente e proteine legate al genoma virale (VPg). La seconda regione (ORFII) codifica per la proteina strutturale maggiore del capside (VP1), mentre il terzo ORF (ORFIII) codifica per la proteina strutturale minore del capside VP2 che agisce stabilizzando la VP1 (Bertolotti-Ciarlet, A., 2002). Nel Norovirus Murino (MNV) è stata recentemente identificata una ORF 4 che codifica per una proteina che si pensa possa avere un ruolo nel facilitare l’evasione dalla risposta immune (Mackenzie & Hyde., 2012).

Tesi di Laurea Magistrale

Facoltà: Scienze Biotecnologiche

Autore: Marzia Pucci Contatta »

Composta da 55 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 1212 click dal 05/06/2013.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.