Questo sito utilizza cookie di terze parti per inviarti pubblicità in linea con le tue preferenze. Se vuoi saperne di più clicca QUI 
Chiudendo questo banner, scorrendo questa pagina, cliccando su un link o proseguendo la navigazione in altra maniera, acconsenti all'uso dei cookie. OK

Due metodi innovativi per correggere la trisomia 21: silenziamento mediato da XIST e rimozione del cromosoma extra

Il genoma umano è composto da 23 coppie di cromosomi. In seguito a mutazioni, però, il patrimonio cromosomico può modificarsi dando origine alle anomalie numeriche (aneuploidie) o strutturali dei cromosomi. Le aneuploidie più frequenti nell’uomo sono le trisomie (presenza di un elemento addizionale in una coppia di cromosomi omologhi). La più frequente trisomia compatibile con la vita è la trisomia del cromosoma 21, causa del 95% dei casi della sindrome di Down. Numerosi sono i problemi clinici causati da questa sindrome, ad esempio: alterazioni nella morfologia facciale; ritardo mentale; anomalie del sistemi cardiovascolare; alto rischio di leucemia ed insorgenza precoce del morbo di Alzheimer.
Per determinare gli effetti della copia extra del cromosoma 21 è necessario comparare cellule geneticamente uguali, a meno del numero di copie del cromosoma 21.
Russel e colleghi hanno derivato cellule disomiche, da una linea cellulare trisomica, inducendo la perdita di una delle tre copie del cromosoma 21. Hanno generato cellule staminali pluripotenti indotte trisomiche a partire da fibroblasti di un individuo affetto da sindrome di Down ed hanno integrato, nel locus APP di una copia del cromosoma 21, il transgene di fusione TKNEO. Il prodotto del gene NEO conferisce alle cellule resistenza all’antibiotico geneticina; il gene TK codifica per la timidina chinasi, che rende le cellule sensibili al ganciclovir. Tra le cellule trasformate, selezionate positivamente in quanto resistenti alla geneticina e poi coltivate per un certo tempo in assenza di geneticina per rendere superfluo il gene di fusione TKNEO, sono state isolate le cellule resistenti al ganciclovir, quindi non più possedenti il gene TK. La causa più comune di sopravvivenza al Ganciclovir è risultata la perdita spontanea dell’intero cromosoma 21 contenente il transgene TKNEO, che generava quindi una linea disomica. Gli autori hanno confermato, tramite analisi di espressione genica globale, la sovraespressione dei geni sul cromosoma 21 nelle cellule trisomiche rispetto alle disomiche ed hanno poi osservato che le cellule disomiche proliferavano più velocemente rispetto alle trisomiche. Hanno svolto analisi anche sul differenziamento cellulare notando che, seppur in vitro il differenziamento in direzione ematopoietica non era considerevolmente diverso tra le due linee, in vivo la linea disomica produceva più cellule endoteliali rispetto alla linea parentale trisomica.
Lawrence e colleghi hanno invece generato cellule trisomiche in cui una copia del cromosoma 21 poteva essere silenziata. Hanno inserito in una copia del cromosoma 21 un costrutto contente il gene XIST sotto il controllo di un promotore indotto da doxiciclina. Il gene XIST produce l’RNA non codificante responsabile del normale silenziamento di una copia del cromosoma X nelle cellule femminili. Dopo l’inserzione, tramite ingegnerizzazione del genoma utilizzando nucleasi zinc finger, e l’induzione del transgene in cellule staminali pluripotenti indotte derivanti da un individuo maschio affetto da sindrome di Down, il cromosoma 21 contenente il transgene veniva sottoposto alle stesse modificazioni che normalmente avvengono sul cromosoma X silenziato, come l’accumulo di particolari modificazioni istoniche e la condensazione del cromosoma a corpo di Barr, risultando non più accessibile al macchinario di trascrizione. Hanno verificato il silenziamento trascrizionale di alcuni geni sul cromosoma 21 ingegnerizzato e hanno constatato che XIST riportava il livello di espressione del cromosoma 21 ad un valore simile a quello di cellule disomiche. Le cellule con un cromosoma X silenziato hanno mostrato una maggior velocità di proliferazione e una maggior efficienza nel differenziamento neuronale. Il cromosoma silenziato, inoltre, rimaneva funzionalmente inattivo anche dopo rimozione dell’induzione di XIST. Hanno infine inserito il transgene in fibroblasti femminili non immortalizzati, osservando che il silenziamento era efficiente anche in questa linea cellulare differenziata.
I due studi hanno quindi proposto due metodi diversi, entrambi risultati efficienti, per correggere in vitro la trisomia 21. La loro applicazione immediata è nell’ambito della ricerca, per ottenere maggiori informazioni sulla patogenesi della sindrome di Down confrontando cellule trisomiche e disomiche derivanti da una stessa linea parentale.
Potrebbero anche essere visti come un primo passo verso una terapia cromosomica. Potrebbero servire per creare in vitro, da cellule prelevate da un paziente affetto da sindrome di Down, cellule geneticamente o funzionalmente disomiche, che possano essere ritrapiantate quando il paziente ne abbia bisogno. Questo processo potrebbe aiutare, fornendo al paziente le sue stesse cellule ma mancanti degli effetti negativi dovuti alla presenza della terza copia del cromosoma 21, nel trattamento di sintomi quali la predisposizione alla leucemia e l’insorgenza precoce del morbo di Alzheimer.

Mostra/Nascondi contenuto.
1 RIASSUNTO Il genoma umano è normalmente composto da 22 coppie di cromosomi omologhi ed una coppia di cromosomi sessuali (XX nelle cellule femminili e XY nelle cellule maschili). In seguito a mutazioni, però, il cariotipo (patrimonio cromosomico) può modificarsi nel numero o nella morfologia dei cromosomi che lo costituiscono, dando così origine, rispettivamente, alle anomalie numeriche (aneuploidie) o strutturali dei cromosomi. Le an e uploi die   più   fr e que nti   ne ll ’uomo   sono   le   trisom ie   (pr e se nz a   di   un   elemento addizionale in una coppia di cromosomi omologhi), che possono alterare i fenotipi cellulari e produrre anomalie congenite. Tra le trisomie compatibili con la vita, la più frequente è la trisomia, completa o parziale, del cromosoma 21 (Hsa21), che è la causa, nel 95% dei casi, della sindrome di Down, riscontrata in circa un bambino su 800. Numerosi sono i problemi clinici causati da questa sindrome, ad esempio: diverse caratteristiche fenotipiche tra le quali alterazioni nella morfologia facciale e bassa statura; ritardo mentale; anomalie a livello dei sistemi cardiovascolare e gastrointestinale; alto rischio di leucemia ed insorgenza precoce del morbo di Alzheimer. Per determinare gli effetti della copia extra del cromosoma 21 sono stati svolti differenti studi comparando cellule disomiche e cellule trisomiche derivanti da individui distinti. I risultati di simili analisi sono però altamente influenzati da differenze genetiche ed epigenetiche tra le cellule comparate, che non permettono di attribuire con certezza un effetto fenotipico al cromosoma in sovrannumero. Per ovviare a questo problema sarebbe necessario comparare cellule geneticamente uguali, a meno del numero di copie del cromosoma 21. Creare cellule disomiche e trisom iche   isogenic he   e c c e tt o   una   c opia   de l   c rom osom a   21   è   l’obie tt ivo   d e i   due   studi   esaminati in questa tesi. Russel e colleghi hanno derivato cellule disomiche, da una linea cellulare trisomica, inducendo la perdita di una delle tre copie del cromosoma 21. Per ottenere queste due linee isogeniche, gli autori hanno generato cellule staminali pluripotenti indotte trisomiche a partire da fibroblasti di un individuo affetto da sindrome di Down ed hanno integrato, nel locus APP di una copia del cromosoma 21, il transgene di fusione TKN EO.   I l   p rodotto   de l   ge ne   NE O   c onf e risc e   a ll e   c e ll ule   re sis tenz a   a ll ’a nti biot ico   g e n e ti c ina,   us a to   c om e   mar c a tore   di   se lez ion e   pe r   l’ a c quisi z ione   de l   tra ns g e ne ,   mentre il gene TK codifica per la timidina chinasi, che rende le cellule sensibili al ganciclovir. Tra le cellule trasformate, selezionate positivamente in quanto resistenti alla geneticina e poi coltivate per un certo tempo in assenza di geneticina per rendere superfluo il gene di fusione TKNEO, gli autori hanno sfruttato la sensibilità al ganciclovir per selezionare negativamente le cellule ancora possedenti il gene TK ed isolare solo quelle diventate GCV resistenti. La causa più comune di sopravvivenza al Ganciclovir è risultata la perdita spontanea del l’int e ro cromosoma 21 contenente il transgene TKNEO, che generava quindi una linea disomica. Ottenuta la linea disomica, gli autori hanno svolto diverse analisi per confrontare questa e la linea parentale trisomica: hanno confermato, tramite analisi dei profili di espressione genica globale, la sovraespressione dei geni sul cromosoma 21 nelle cellule trisomiche rispetto alle disomiche ed hanno poi analizzato la proliferazione cellulare osservando che le cellule disomiche proliferavano più velocemente rispetto alle trisomiche. Hanno svolto analisi anche sul differenziamento cellulare notando che, seppur in vitro il differenziamento in direzione ematopoietica non era considerevolmente diverso tra le due linee, in vivo la linea disomica produceva più cellule endoteliali rispetto alla linea parentale trisomica. Tramite questo metodo di rimozione mirata di una trisomia gli autori hanno potuto determinare alcune caratteristiche delle cellule trisomiche

Laurea liv.I

Facoltà: Scuola di scienze

Autore: Simona Sala Contatta »

Composta da 70 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 155 click dal 11/05/2017.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.