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Effetti molecolari della Cortical Spreading Depression sulle DNA metiltrasferasi e sullo stato di metilazione del DNA in sistemi modello

Estrazione di RNA totali dalla corteccia cerebrale di ratto

L’RNA viene estratto dalla corteccia cerebrale di ratti trattati per Cortical Spreading Depression, e sacrificati dopo 24 ore dall’induzione della stessa. Il protocollo utilizzato per l’estrazione è basato sul reagente TRIzol, una soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato. Pestello, mortaio, bisturi e pinzette vengono sterilizzati mediante immersione in una soluzione di NaOH 0.1 M per 10 minuti e successivamente sottoposti ad un primo lavaggio in acqua distillata ed un secondo lavaggio in acqua DEPC. Pestello e mortaio sono preraffreddati ponendoli in un basket pieno di ghiaccio secco, e il tessuto da processare viene pesato su di una bilancia analitica agendo velocemente per evitare che si scongeli. Subito dopo viene trasferito nel mortaio dove viene versato dell’azoto liquido e subito polverizzato con l’aiuto del pestello. Il tessuto polverizzato viene trasferito in un tubo sterile da 2 mL dove viene aggiunto TRIzol in ragione di 1mL ogni 100mg, il tutto viene trasferito in un potter dounce dove il tessuto viene disgregato del tutto. Questa operazione richiede circa 1-2 minuti e viene condotta mantenendo il potter in ghiaccio per evitare l’eccessivo riscaldamento della soluzione.

Dopo l’omogenizzazione, il materiale insolubile viene rimosso dall’omogenato mediante centrifugazione a 12000 g per 10 minuti a 4°C in centrifuga Eppendorf 5415D. A questo punto viene recuperato il surnatante contenente l’RNA e incubato per 5 minuti a temperatura ambiente per favorire la dissociazione dei complessi nucleoproteici. Vengono poi aggiunti 200 µL di cloroformio per ogni mL di TRIzol iniziale e si mescola vigorosamente per circa 15 secondi, la soluzione viene lasciata per tre minuti a temperatura ambiente e poi si centrifuga a 12000g per 15 minuti a 4°C. La centrifugazione separa la fase inferiore di fenolo-cloroformio dalla fase superiore acquosa contenente l’RNA che viene recuperata e posta in un altro tubo sterile da 1,5 mL. L’RNA viene riprecipitato dalla fase acquosa superiore aggiungendo circa 500 µL di isopropanolo per ogni mL iniziale di reagente TRIzol e si lascia in incubazione a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo di ciò si centrifuga a 12000 g per 10 minuti a 4 °C, si rimuove il supernatante e si lava una volta il pellet con 500 µL di etanolo diluito al 75% con acqua DEPC (dietilpirocarbonato che inibisce le RNasi ). Si centrifuga a 12000 g per 5 minuti a 4 °C, si elimina l’etanolo e si lascia asciugare il pellet per almeno 10 minuti in cappa sterile a flusso laminare in ghiaccio. Infine l’RNA viene risospeso in circa 20 μL di acqua trattata con DEPC, e posto per 10 minuti a 60 °C per aiutare la solubilizzazione del pellet. La concentrazione dell’RNA estratto viene determinata con uno spettrofotometro (NanoDrop 1000 Thermo Scientific). L’esattezza di tale concentrazione e l’integrità dell’RNA è verificata mediante elettroforesi dell’RNA su gel di agarosio in condizioni denaturanti ed il grado di purezza della preparazione è stato determinato calcolando il rapporto tra assorbanza a 260 nm e quella a 280 nm che per un RNA puro è compreso tra 1,5 ed 1,8.

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Effetti molecolari della Cortical Spreading Depression sulle DNA metiltrasferasi e sullo stato di metilazione del DNA in sistemi modello

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Informazioni tesi

  Autore: Sara Rainone
  Tipo: Tesi di Laurea Magistrale
  Anno: 2012-13
  Università: Università degli Studi di Napoli - Federico II
  Facoltà: Scienze Biologiche
  Corso: Biologia molecolare e cellulare
  Relatore: Laura Fucci
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 116

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dna
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