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Effetti molecolari della Cortical Spreading Depression sulle DNA metiltrasferasi e sullo stato di metilazione del DNA in sistemi modello

Estratto della Tesi di Sara Rainone

Estratto dalla tesi: Effetti molecolari della Cortical Spreading Depression sulle DNA metiltrasferasi e sullo stato di metilazione del DNA in sistemi modello
Materiali e Metodi 
 
27 
 
entrambi i campioni a 37°C per un’ora. Al termine dalla prima incubazione è stata 
ripetuta l’aggiunta di Proteinasi K (a concentrazione finale 0,12 mg/mL) e si sono 
lasciati in incubazione i campioni overnight a 37°C. Si è proceduto all’allontanamento 
delle proteine aggiungendo a ciascun campione un volume di fenolo : clorofomio : alcol 
isoamilico (in rapporto 25:24:1), mescolando per inversione ciascuna provetta e 
centrifugando a 15000 g per 5 minuti (in centrifuga Microfuge 18, Beckman); la fase 
acquosa, contenente il DNA di interesse, è stata trasferita in un tubo pulito. Dopo aver 
ripetuto il passaggio precedente per ciascun campione e recuperato la fase acquosa è 
stata aggiunta alla stessa un volume di cloroformio : alcol isoamilico (in rapporto 24:1) 
al fine di poter allontanare eventuali residui di fenolo. I residui sono stati nuovamente 
miscelati per inversione, sottoposti a centrifugazione a 15000 g per 5 minuti (in 
centrifuga Microfuge 18, Beckman) e il surnatante è stato trasferito in un tubo pulito. Il 
DNA in soluzione è stato quindi precipitato mediante aggiunta di 0,1 volumi di Sodio 
Acetato 3M pH 7 e di 2,5 volumi di Etanolo 96% e successiva incubazione dei 
campioni a -20°C per un’ora; successivamente i campioni sono stati sottoposti a 
centrifugazione per 15 min a 20000 g a 4°C. I pellets ottenuti sono sottoposti ad un 
lavaggio in etanolo al 70% e ricentrifugati per 10 min a 20000 g a 4°C. I pellets di DNA 
così ottenuti sono stati risospesi in 100 μL di TE (Tris-HCl 10 mM pH 8; EDTA 1 mM 
pH 8). Il DNA genomico estratto deve essere sottoposto a trattamento con RNasi al fine 
di degradare l’RNA presente, poiché l’anticorpo anti-5’metilcitosina, utilizzato negli 
esperimenti successivi, riconosce e lega anche la 5’metilcitosina presente nelle molecole 
di RNA. A tale scopo, 50 µg di ciascun campione sono stati sottoposti a trattamento con 
RNAsi Dnasi Free (Roche; concentrazione finale 30 μg/mL) e si è proceduto

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Effetti molecolari della Cortical Spreading Depression sulle DNA metiltrasferasi e sullo stato di metilazione del DNA in sistemi modello

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Informazioni tesi

  Autore: Sara Rainone
  Tipo: Tesi di Laurea Magistrale
  Anno: 2012-13
  Università: Università degli Studi di Napoli - Federico II
  Facoltà: Scienze Biologiche
  Corso: Biologia molecolare e cellulare
  Relatore: Laura Fucci
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 116

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dna
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