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Analisi proteomica del tessuto renale di gatti abissini affetti da amiloidosi

Estratto della Tesi di Luca Diamante

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Estratto dalla tesi: Analisi proteomica del tessuto renale di gatti abissini affetti da amiloidosi
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2.2 Deparaffinazione ed estrazione proteica 
Da ciascuno dei campioni di tessuto renale FFPE, mediante microtomo, si sono 
ottenute 9 sezioni istologiche con uno spessore pari a 10 µm che sono state depositate 
su un vetrino.  Uno di questi vetrini è stato utilizzato per la colorazione rosso Congo 
mentre gli altri 8 hanno subito il processo di deparaffinazione, che permette di eliminare 
la paraffina e ottenere il campione di tessuto pulito. Ogni sezione è stata 
deparaffinizzata e reidratata mediante successivi lavaggi con: xylene (2 x 10 minuti), 
etanolo al 100% (2 x 5 minuti), al 95% (1 x 5 minuti) e al 70% (1 x 5 minuti), acqua (1 
x 5 minuti) e buffer Tris HCl 50 mM a pH 8. 
Al fine di indurre la lisi del tessuto ed estrarre le proteine, i tessuti sono stati 
omogeneizzati con omogeneizzatore Potter 3 volte, per 1 minuto e al massimo della 
velocità, in 500 µL di urea 8M, ammonio bicarbonato 50 mM, Hepes 20 mM a pH 8, 
con l’aggiunta di un cocktail per l’inibizione proteasica, L’omogenato è stato 
centrifugato a 4°C per 15 minuti alla velocità di 15000 RPM in modo da provocare la 
sedimentazione del tessuto non omogeneizzato. Il surnatante contenente le proteine 
estratte è stato prelevato, trasferito in nuove provette ed utilizzato per il dosaggio del 
materiale proteico in esso contenuto mediante il saggio di Bradford. 
2.3 Dosaggio proteico 
Il contenuto proteico dei campioni è stato dosato mediante il saggio di Bradford, un 
metodo di misurazione spettrofotometrica molto comune in quanto rapido e semplice. 
Tale saggio quantitativo prevede l’utilizzo di CBBG, ossia Coomassie Brillant Blue G-
250 (anche noto come colorante di Bradford) che in forma anionica è in grado di legarsi 
ai residui di arginina, triptofano, istidina, fenilalanina e tirosina. Il CBBG, in condizioni 
acide, presenta un colore bruno, ma una volta formato il complesso con i residui 
amminoacidici precedentemente elencati assume un colore blu. Il saggio è di tipo 
quantitativo quindi lo sviluppo di colore blu è direttamente proporzionale alla quantità 
di proteina presente nel campione. La quantificazione avviene misurando l’assorbanza 
a 595 nm mediante lo spettrofotometro Hewlett Packard 8453.   
Per risalire alla concentrazione proteica di un campione è necessario creare una retta 
di taratura che consenta di correlare dei valori di assorbanza con dei valori di 
concentrazione proteica. La proteina usata come proteina standard è l’albumina sierica 
bovina (BSA). Per questo esperimento sono state preparate 7 cuvette di plastica 
contenenti:

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Analisi proteomica del tessuto renale di gatti abissini affetti da amiloidosi

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Informazioni tesi

  Autore: Luca Diamante
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2018-19
  Università: Università degli Studi di Milano
  Facoltà: Scienze Biotecnologiche
  Corso: Biotecnologie veterinarie
  Relatore: Gabriella Tedeschi
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 33

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Parole chiave

spettrometria di massa
bioinformatica
analisi funzionale
proteomica
amiloidosi
espressione proteica
materiali e metodi
proteomics shotgun
gatti abissini

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