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Proteomica comparativa applicata allo studio di specifici profili proteici

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Indice della tesi: Proteomica comparativa applicata allo studio di specifici profili proteici, Pagina 1
Tesi	
  di	
  Laurea	
  Magistrale	
  in	
   Scienze	
  Chimiche	
   	
  
Antonio	
  Rosato 	
   	
   Indice	
  
	
  
	
  
INDICE	
  
INDICE	
   _________________________________________________________________________________________________________	
   I	
  
1.	
  INTRODUZIONE 	
   __________________________________________________________________________________________	
   1	
  
2.	
   CONTESTO	
  APPLICATIVO 	
   ____________________________________________________________________________	
   2	
  
2.1.	
   IL	
  MORBO	
  DI	
   PARKINSON	
  _____________________________________________________________________________	
   2	
  
2.1.1.	
   Eziologia	
   _______________________________________________________________________________________	
   3	
  
2.1.2.	
   Fibroblasti	
  come	
  cellule	
  modello	
  per	
  lo	
  studio	
  del	
  Parkinson 	
   _______________________________	
   3	
  
3.	
   LA	
  PROTEOMICA 	
  ______________________________________________________________________________________	
   4	
  
3.1.1.	
   Proteomica	
  e	
  studio	
  delle	
  modificazioni	
  post -­‐traduzionali	
  (PTMsonica) 	
  __________________	
   5	
  
3.2.	
   TECNOLOGIE	
  _________________________________________________________________________________________	
   7	
  
3.3.	
   ELETTROFORESI	
  BIDIMEN SIONALE	
   ____________________________________________________________________	
   8	
  
3.3.1.	
   Preparazione	
  dei	
  campioni	
  per	
  l’analisi 	
  _____________________________________________________	
   9	
  
3.3.2.	
   Dosaggio	
  delle	
  proteine 	
   _____________________________________________________________________	
  11	
  
3.3.3.	
   La	
  focalizzazione	
  isoelettrica	
  (IEF) 	
  ________________________________________________________	
  12	
  
3.3.4.	
   Poliacrilamide	
  gel	
  Elettroforesi	
  (SDS -­‐PAGE)	
  ______________________________________________	
  14	
  
3.3.5.	
   Rivelazione	
  delle	
  proteine	
  sul	
  gel 	
   ___________________________________________________________	
  15	
  
3.3.6.	
   Analisi	
  delle	
   immagini	
  ______________________________________________________________________	
  16	
  
3.4.	
   IDENTIFICAZIONE	
  DELLE 	
   PROTEINE:	
  SPETTROMETRIA	
  DI	
   MASSA	
   _____________________________________	
   17	
  
3.4.1.	
   Proteomica	
  e	
  spettrometria	
  di	
  massa:	
  Sorgenti	
  tipiche 	
   ___________________________________	
  18	
  
3.4.2.	
   M.A.L.D.I.	
   _____________________________________________________________________________________	
  18	
  
3.5.	
   ANALIZZATORI	
  DI	
  MASSA 	
  ___________________________________________________________________________	
   20	
  
3.5.1.	
   TOF	
   ___________________________________________________________________________________________	
  20	
  
3.5.2.	
   Reflectron:	
  Aumento	
  della	
  Risoluzione 	
   _____________________________________________________	
  21	
  
3.6.	
   PEPTIDE	
   MASS	
   FINGERPRINT	
   _______________________________________________________________________	
   22	
  
3.6.1.	
   Digestione	
  degli	
  spot 	
   ________________________________________________________________________	
  22	
  
3.6.2.	
   Perché	
  la	
  tripsina? 	
  __________________________________________________________________________	
  23	
  
3.6.3.	
   Match	
  mancanti 	
   _____________________________________________________________________________	
  24	
  
3.7.	
   ANALISI	
  DEI	
  RISULTATI 	
   TRAMITE	
  BIOINFORMATI CA	
   __________________________________________________	
   25	
  
3.7.1.	
   Identificazione	
  delle	
  proteine 	
   _______________________________________________________________	
  25	
  
3.7.2.	
   Il	
  software	
  di	
  ric erca	
  MASCOT	
  e	
  valutazione	
  del	
  risultato 	
   ________________________________	
  26	
  
4.	
   ATTIVITA’	
  SVOLTA 	
   __________________________________________________________________________________	
   28	
  
4.1.	
   ALLESTIMENTO	
  DELLE	
   COLTURE	
  DI	
  FIBROBLAST I	
   ____________________________________________________	
   28	
  
4.2.	
   ELETTROFORESI	
   BIDIMENSIONALE	
   __________________________________________________________________	
   29	
  
4.2.1.	
   Preparazione	
  delle	
  proteine	
  cellulari 	
  ______________________________________________________	
  29	
  

Tesi	
  di	
  Laurea	
  Magistrale	
  in	
   Scienze	
  Chimiche	
   	
  
Antonio	
  Rosato 	
   	
   Indice	
  
	
  
	
  
4.2.2.	
   Isoelettrofocalizzazione	
  delle	
  proteine 	
   _____________________________________________________	
  30	
  
4.2.3.	
   Equilibrazione	
  delle	
  Strip 	
   ___________________________________________________________________	
  30	
  
4.2.4.	
   Seconda	
  dimensione:	
  SDS -­‐PAGE	
   ____________________________________________________________	
  31	
  
4.3.	
   IDENTIFICAZIONE	
  DELLE 	
   PROTEINE	
   _________________________________________________________________	
   32	
  
4.3.1.	
   Digestione	
  in	
  gel	
  di	
  proteine	
  separate	
  tramite	
  elettroforesi 	
  ______________________________	
  32	
  
4.3.2.	
   Descrizione	
  dello	
  spettrometro	
  MALDI	
  utilizzato	
  per	
  le	
  analisi 	
  __________________________	
  33	
  
4.3.3.	
   Preparazione	
  dei	
  Campioni	
  per	
  l’Analisi:	
  deposizione	
  degli	
  spot	
  sulla	
  target-­‐ plate	
   _____	
  34	
  
4.3.4.	
   Deposito	
  della	
  miscela	
  di	
  calibrazione 	
  _____________________________________________________	
  34	
  
4.3.5.	
   Acquisizione	
  degli	
  spettri 	
  ___________________________________________________________________	
  35	
  
4.3.6.	
   Elaborazione	
  dei	
  segnali	
  e	
  ricerca	
  in	
  banca	
  dati 	
  __________________________________________	
  35	
  
5.	
   RISULTATI	
  E	
  DISCUSSI ONE	
  ________________________________________________________________________	
   36	
  
5.1.	
   GEL	
   BIDIMENSIONALI	
   _______________________________________________________________________________	
   36	
  
5.2.	
   ANALISI	
  MEDIANTE	
  SPET TROMETRIA	
  DI	
  MASSA 	
   ______________________________________________________	
   40	
  
5.2.1.	
   Analisi	
  degli	
  spot 	
  ____________________________________________________________________________	
  40	
  
5.2.2.	
   Risultati	
  delle	
  identificazioni 	
  _______________________________________________________________	
  41	
  
5.2.3.	
   La	
  Vimentina	
   ________________________________________________________________________________	
  54	
  
6.	
   STUDIO	
  DELLE	
  MODIFICHE	
  POST-­‐ TRADUZIONALI	
  DELLA	
  VIMENTINA 	
  ____________________	
   56	
  
6.1.	
   FOSFORILAZIONE	
  E	
  FOSF OPROTEOMICA	
   _____________________________________________________________	
   57	
  
6.1.1.	
   Risultati	
  della	
  ricerca	
  in	
  banca	
  dati	
  per	
  le	
  fosforilazioni 	
   __________________________________	
  60	
  
6.1.2.	
   Ricerca	
  dei	
  segnali	
  di	
  de -­‐fosforilazione	
  ____________________________________________________	
  72	
  
6.1.3.	
   Defosforilazione	
  in	
  situ	
  con	
   alcalin-­‐fosfatasi	
  ______________________________________________	
  73	
  
6.1.4.	
   Studio	
  delle	
  Acetilazioni 	
  ____________________________________________________________________	
  74	
  
6.1.5.	
   Ricerca	
  delle	
  acetilazioni 	
  ___________________________________________________________________	
  75	
  
6.1.6.	
   Ricerca	
  delle	
  acetilazioni	
  e	
  delle	
  fosforilazioni	
  sullo	
  stesso	
  peptide 	
  ______________________	
  82	
  
7.	
   CONCLUSIONI	
   ________________________________________________________________________________________	
   92	
  
8.	
   APPENDICE	
   ___________________________________________________________________________________________	
   93	
  
8.1.	
   SPETTRI	
  DI	
   MASSA	
  DEI	
  CAMPIONI	
  NO N	
  TRATTATI	
  CON	
  FOSFA TASI	
  ALCALINA 	
   _________________________	
   93	
  
8.2.	
   SPETTRI	
  DI	
  MASSA	
  DEI	
   CAMPIONI	
  TRATTATI	
  CO N	
  FOSFATASI	
  ALCALINA 	
   _______________________________	
   99	
  
9.	
   NOTE	
  PERSONALI 	
  _________________________________________________________________________________	
  105	
  
10.	
   BIBLIOGRAFIA	
  ___________________________________________________________________________________	
  109	
  

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Indice dalla tesi:

Proteomica comparativa applicata allo studio di specifici profili proteici

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Informazioni tesi

  Autore: Antonio Rosato
  Tipo: Laurea II ciclo (magistrale o specialistica)
  Anno: 2012-13
  Università: Università degli Studi di Bari
  Facoltà: Chimica
  Corso: Scienze chimiche
  Relatore: Gerardo Palazzo
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 117

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