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Induzione di plasticità sinaptica nel circuito cerebellare in vivo

Nel nostro laboratorio di ricerca sono stati condotti numerosi studi in vitro riguardanti fenomeni plastici allo stadio di input della corteccia cerebellare. Scopo della presente tesi è quindi quello di verificare la presenza di plasticità sinaptica a lungo termine in vivo, in risposta alla stimolazione sensoriale e a quella elettrica intracerebellare. Per i nostri esperimenti abbiamo utilizzato ratti Wistar di età compresa tra 19 e 26 giorni. L’anestetico usato era l’uretano, che veniva iniettato per via i.p. alla dose di 1.35 – 1.50 g/kg. Quindi, si praticava la neurochirurgia stereotassica fino a esporre il folium Crus IIa dell’emisfero cerebellare e in alcuni esperimenti l’area somatosensoriale primaria della neocorteccia. La stimolazione sensoriale consisteva di un breve getto d’aria sul cuscinetto mustaciale. Per la stimolazione elettrica veniva usato un elettrodo coassiale di tungsteno. Le derivazioni erano condotte impiegando pipette di vetro. Infine, sono stati utilizzati alcuni farmaci: gabazina 0.5 mM (bloccante dei recettori GABAA) in ambedue le fasi sperimentali di studio della plasticità, mentre solo con stimolazione sensoriale abbiamo impiegato anche D-APV 1 mM (bloccante dei recettori NMDA) e serotonina (un modulatore dell’apprendimento). Durante la discesa dell’elettrodo verso lo strato granulare, dal quale venivano derivati i segnali, la presenza di attività nervosa spontanea permetteva di discriminare i vari strati corticali secondo pattern già registrati in fettina. La risposta dello strato granulare evocata mediante stimolazione con getto d’aria tipicamente era costituita dal susseguirsi di tre onde: T, C e D. La prima componente era di origine trigeminale. L’onda C originava dal loop cortico-ponto cerebellare (ipotesi confermata dagli esperimenti in cui veniva esposta anche l’area somatosensoriale primaria). La componente a lunga latenza D (delayed), invece, non era mai stata riportata in precedenza e probabilmente rappresentava la scarica ritardata derivante da un pathway polisinaptico. Dopo aver ottenuto un segnale stabile per almeno mezzora con la procedura di controllo (stimolazione a 0.1 Hz), per indurre plasticità con stimolazione sensoriale veniva utilizzato un protocollo chiamato TSS (theta-frequency sensory stimulation). Esso consisteva di 5 impulsi da 50 ms erogati a ritmo theta (4 Hz). La frequenza theta è la stessa a cui avviene il whisking, ovvero un comportamento esplorativo tattile attivo. L’analisi è stata limitata al solo picco T in ragione della sua origine da una via sinaptica diretta e relativamente semplice. L’effetto della semplice applicazione di TSS in assenza di farmaci è stato un prevalere dell’LTD. Al contrario, in presenza di gabazina l’effetto netto è stato un potenziamento della risposta. Effetto analogo a quello della gabazina ha avuto la serotonina (5-HT) applicata subito prima del TSS, con un notevole potenziamento. Infine, è stata osservata una significativa depressione della risposta durante la stimolazione di controllo (0.1 Hz) in presenza di gabazina. Abbiamo poi verificato se tale forma di plasticità fosse NMDA-dipendente: l’applicazione di una soluzione contenente gabazina e D-APV, aggiunta subito prima del TSS o durante la stimolazione di controllo, preveniva ogni cambiamento a lungo termine della risposta osservato nelle medesime condizioni sperimentali ma senza D-APV. A questo punto ci siamo chiesti se la plasticità si verificasse effettivamente nello strato granulare del cervelletto o se, per esempio, avesse luogo nel nucleo del trigemino con conseguente invio di input modificati alla corteccia cerebellare. In ragione di ciò, si è resa necessaria una seconda fase sperimentale di studio della plasticità: si è cioè praticata la stimolazione elettrica intracerebellare. La stimolazione diretta della materia bianca (fascio di fibre muscoidi) generava le stesse risposte di campo nello strato granulare ritrovate in fettina. In particolare, N1 è il potenziale presinaptico generato nelle fibre muscoidi, mentre N2 e SN sono le componenti postsinaptiche generate dall’attivazione dei granuli. Inoltre, come in fettina, nel 33 % dei casi, l’onda N1 risultava divisa in due picchi chiaramente distinguibili: N1a e N1b. Per l’induzione di plasticità con stimolazione elettrica si è utilizzato il medesimo protocollo usato in vitro, il TBS (theta-burst stimulation). La stimolazione elettrica ad alta frequenza induceva modifiche consensuali di tutti i potenziali, eccetto la componente presinaptica N1a, che rimaneva costante in ampiezza come del resto osservato in vitro. Infine, in 4 casi l’aggiunta di gabazina subito prima del TBS determinava in SN LTP: l’assenza di inibizione sinaptica provoca, come con stimolazione sensoriale e in vitro, uno shift da LTD a LTP. In conclusione, vari motivi ci inducono a ritenere che la forma di plasticità osservata in vivo corrisponda a quella generata in vitro da TBS alla sinapsi tra fibra muscoide e cellula granulare.

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1 1. INTRODUZIONE Il sistema nervoso è in grado di elaborare una grande quantità di informazioni provenienti dal mondo esterno. Il flusso dell’informazione generato dall’attivazione dei recettori sensoriali guida il segnale attraverso il sistema somatosensoriale. In particolare, il controllo sensori-motorio è di importanza fondamentale per stabilire una corretta relazione tra l’organismo e l’ambiente. Una struttura di notevole rilievo in tal senso è il cervelletto. Nonostante gli effetti della lesione cerebellare siano noti da tempo e numerosi modelli teorici siano stati proposti per spiegarne il funzionamento, i meccanismi operativi della rete cerebellare rimangono tuttora largamente sconosciuti. La corteccia cerebellare presenta due regioni ben definite: lo strato granulare, e quello molecolare e delle cellule del Purkinje. Lo strato granulare riceve l’afferenza dalle fibre muscoidi che eccitano le cellule granulari e le cellule del Golgi. Queste ultime inibiscono i granuli mediante circuiti a feedforward e a feedback. Recentemente, notevoli progressi sono stati compiuti nel campo della fisiologia cellulare mostrando in modo sempre più preciso la funzione di singolo neuroni e sinapsi. Tuttavia, si sente ora l’esigenza di riportare tali conoscenze ad un contesto funzionale più ampio mediante registrazioni nel cervelletto in vivo. Un utile modello per studiare la codificazione e trasmissione dei segnali nervosi è l’animale anestetizzato, dove è preservata l’integrità del circuito neurale. In particolare, sono state utilizzate la stimolazione tattile faciale e quella elettrica intracerebellare nel ratto in vivo, simultaneamente a registrazioni dal cervelletto stesso. Sono state studiate per esteso le risposte caratteristiche dello strato granulare alla stimolazione tattile negli emisferi cerebellari di ratti anestetizzati. È ben noto che una regione del cervelletto, la Crus IIa, riceve una grande quantità di input afferenti dalla zona periorale e dai baffi. Registrazioni focali da tale area mostrano una risposta evocata dalla stimolazione sensoriale di tipo tattile che deriva principalmente dall’attivazione di due vie nervose: quella trigeminale e quella corticale (Morissette and Bower, 1996). Recentemente, è stato scoperto che l’attivazione delle fibre muscoidi evocata dalla stimolazione tattile induce treni di potenziali di azione (spike burst) nelle cellule granulari (Chadderton et al., 2004). Inoltre è stato dimostrato che, in vitro, l’attivazione delle fibre muscoidi mediante un pattern di stimolo tipo theta-burst, unitamente alla depolarizzazione

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Informazioni tesi

  Autore: Bruno Alessandro Rivieccio
  Tipo: Laurea vecchio ordinamento (pre riforma del 1999)
  Anno: 2005-06
  Università: Università degli Studi di Pavia
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Scienze Biologiche
  Relatore: Egidio Ugo D'Angelo
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 499

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Parole chiave

in vivo
cervelletto
ratto
plasticità sinaptica

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