Isolamento di una nuova malico deidrogenasi da semi di Ceratonia siliqua L. con possibili impieghi in campo biotecnologico

La Tripsina, dall'inglese trypsin, tratto dal greco trîpsis, che significa sfregamento (con allusione al primo sistema di preparazione), è un enzima proteolitico, o proteasi, elaborato e secreto dal pancreas nella forma di un precursore inattivo detto tripsinogeno. Questo è un polipeptide, costituito da 249 amminoacidi, che viene attivato a livello intestinale dalla enterochinasi secreta dalla mucosa del duodeno o dalla stessa tripsina. Dal punto di vista molecolare il processo di attivazione consiste nel distacco dalla struttura del tripsinogeno di un frammento esapeptidico, formato dalla valina, dalla lisina e dall'acido aspartico (Kennedy, 1998).
La tripsina è una endopeptidasi, scinde i legami peptidici dei polipeptidi e delle proteine allo stato nativo, agendo esclusivamente sui peptidi nei quali sono presenti un residuo di lisina o di arginina. L'attività catalitica si svolge a pH compreso tra 6 e 9, con un massimo a pH 7,0, in presenza di sali di calcio. L'azione della tripsina è massima nel primo tratto dell'intestino tenue e si riduce progressivamente nell'ultimo tratto dell'ileo, dove l'enzima viene in parte distrutto o riassorbito (Huber and Bode, 1978).
Gli inibitori di proteasi svolgono principalmente un ruolo importante nella difesa chimica dall’attacco di patogeni e alcuni di questi composti causano danni talmente seri nell’apparato digerente di alcuni insetti da risultare fatali. La presenza degli inibitori di proteasi non è solo dovuta all’attacco di patogeni o a seguito di condizioni di stress, essi possono anche essere sintetizzati in maniera costitutiva in diversi organi della pianta, per tutti i processi necessari per la regolazione di proteasi (Barret and Salvesen, 1986).
Gli inibitori di proteasi contengono dei siti attivi per disattivare proteasi esercitando un’azione inibente.
Nelle leguminose sono state individuate due classi di inibitori di proteasi: Inibitori di Kunitz e Inibitori di Bowman-Birk. Nel primo caso si tratta di polipeptidi del peso molecolare di circa 22 kDa che inibiscono l’attività della tripsina attraverso un singolo sito attivo. Sono proteine globulari con rare strutture ad α-elica e formate da alcuni foglietti irregolari β ripiegati. I contatti stabiliti fra l’inibitore e la tripsina sono dati dalla sequenza Ser-Tyr-Arg-Ile-Arg-Phe che forma un anello ricurvo che si protende dal corpo globulare dell’inibitore (Ragg et al., 2006).
Gli inibitori Bowman-Birk sono invece proteine da circa 8 kDa caratterizzata dalla presenza di numerosi ponti disolfuro che formano una struttura rigida che conferisce una elevata stabilità della molecola alle condizioni di forte acidità ed elevata temperatura. A differenza dell’inibitore di Kunitz questo tipo di molecole agisce inibendo sia la tripsina che la chimotripsina mediante due siti attivi completamente indipendenti. Il sito per la tripsina è definita Lys-Ser, quello per la chimotripsina Leu-Ser (Maffei, 1998). [...]