Costruzione e caratterizzazione di una immuno-RNasi con attività antitumorale

Il titolo della tesi sperimentale in Chimica Biologica è il seguente:
“Costruzione e caratterizzazione di una immuno-RNasi con attività antitumorale” ed è stata svolta presso il Dipartimento di Chimica Organica e Biologica dell’Università degli Studi di Napoli “Federico II”.
Il progetto di costruzione di una immuno-RNasi prevede la preparazione di un costrutto chimerico contenente la ribonucleasi pancreatica umana (HP-RNasi) e il frammento sFv dell’anticorpo monoclonale MgR6 diretto contro il recettore ErbB2. Tale costrutto infatti può essere di grande interesse farmacologico per la presenza di una proteina di origine umana che svolge la funzione di tossina e di un anticorpo molto selettivo per le cellule tumorali derivanti da adenocarcinomi, in particolare quelli della mammella.
Scopo di questa tesi è quindi la costruzione, espressione e caratterizzazione di una immunoRNasi, indicata con la sigla sFvM-L15-HP, sulla base delle entità che lo compongono: la porzione anticorpale derivante dall’anticorpo MgR6 (M), la ribonucleasi HP-RNasi (HP), la regione spaziatrice interposta tra la tossina e l’anticorpo, lunga 15 residui (L15).
Questo lavoro di tesi si propone inoltre di affrontare il problema di una efficiente internalizzazione del costrutto in cellule tumorali che esprimono il recettore ErbB2.
L’internalizzazione dell’anticorpo è mediata da un evento di dimerizzazione del recettore, evento che è reso possibile dalla presenza di due siti di legame per l’antigene sulla molecola dell’immunoglobulina, i quali, riconoscendo ciascuno una molecola di recettore, favoriscono l’aggregazione di due molecole in una struttura dimerica. Poiché il frammento sFv presenta un solo sito di legame per l’antigene, si è pensato di ingegnerizzare la immunoRNasi, in modo tale che presenti due siti combinatori per l’antigene. Questo è possibile quando l’oligopeptide che connette la regione variabile della catena pesante con quella della catena leggera è sufficientemente corto da non permettere l’appaiamento intramolecolare delle stesse e da indurre invece l’appaiamento intermolecolare tra due diversi sFv.
Il risultato dell’appaiamento forzato tra porzioni anticorpali di due molecole diverse porta alla formazione di “diabodies” ovvero di frammenti anticorpali bivalenti, cioè dotati di un doppio sito di riconoscimento per l’antigene.
Pertanto lo scopo di questa tesi è duplice: la costruzione della immunoRNasi sFvM-L15-HP, la sua espressione, l’isolamento e la caratterizzazione, nonché la costruzione di una sua variante in cui il segmento congiungente le regioni VH e VL è accorciato da 15 residui amminoacidici, a 5 residui. Tale variante è stata chiamata sFvM-L5-HP.
Le immunoRNasi preparate con questo lavoro di tesi potrebbero rappresentare un punto di partenza per successive analisi che saranno volte alla sostituzione della porzione anticorpale, di origine murina, con una di origine umana, così da ottenere una immunoRNasi umana.